抗上皮细胞生长抑制因子对膀胱癌细胞的增殖及c-Jun与HB-EGF蛋白表达的影响

李泽良，季德才，张丽

（1.中国医科大学 附属第一医院泌尿外科，沈阳 110001；2.美国马里兰大学医学院神经科，美国马里兰州 巴尔地摩 21201）

抗上皮细胞生长抑制因子（antiproliferative factor，APF）由Keay等［1］首先发现于间质性膀胱炎（interstitial cystitis，IC）患者的尿液中，并偶然发现其具有抗膀胱肿瘤细胞生长的作用。目前，国内尚无关于APF对膀胱移行细胞癌方面研究的报道。本研究通过四唑盐比色法（MTT）、Western blot探讨了不同浓度的有活性APF及无活性APF对人膀胱移行细胞癌细胞株T-24细胞生长增殖的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱移行细胞癌T-24细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心；有活性与无活性的APF购自Peptide公司；MTT购自Applygen Technologies公司；人肝素结合性表皮生长因子（recombinant human heparin binding EGF-like growth factor，HB-EGF）一抗购自Santa Cruz公司；兔抗人纯化anti-c-Jun一抗购自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：T-24细胞培养于RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞对数生长期，随机将细胞分为6组，并加入不同浓度 APF：有活性 APF 0，0.5，1.0 μg/ml组，无活性APF 0，0.5，1.0 μg/ml组。

1.2.2 MTT检测细胞增殖情况：将细胞悬液100μl（1×106个细胞）加入 96孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞对数生长期，含不同浓度APF的培养基200μl加入孔内，培养48 h，每孔加入20μl MTT溶液，继续培养4 h。酶联免疫检测仪检测490 nm处各孔的吸光值。每组设4个复孔，重复3次。各组吸光值用x±s表示。

1.2.3 Western-blot检测c-Jun及HB-EGF蛋白的表达：向各组细胞中加入细胞裂解缓冲液，提取细胞全蛋白，测定蛋白浓度，取20μg蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移至硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1 h，一抗溶液（用0.1%BSA稀释200～2 000倍）室温下振荡孵育2 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液（用0.1%的BSA稀释2 000倍），室温下振荡孵育1.5～2 h。碱性磷酸酶法显色后，行透视扫描（Acer），采用灰度分析软件（联合生物公司，北京）分析灰度值。β-actin用作内参照。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件，计量资料以x±s表示，各组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT结果（图1）

有活性 APF 0μg/ml组、0.5μg/ml组、1.0μg/ml组及无活性APF组吸光值分别为0.968±0.042、0.729±0.024、0.445±0.035、0.994±0.059，有活性 APF 0μg/ml组、0.5μg/ml组、1.0μg/ml组之间比较有统计学差异（P<0.05）。

2.2 Western blot结果

对Western blot结果进行半定量分析，结果显示，有活性 APF 对 c-Jun（图 2）和 HB-EGF（图 3）蛋白的表达有抑制作用，并且随浓度的增加该抑制作用增强，而无活性APF对两者则无抑制作用。统计学分析结果显示，不同浓度有活性APF组之间差异有统计学意义（P<0.05），无活性的APF各组与有活性APF 0μg/ml组之间无统计学差异（P>0.05）。

3 讨论

抗上皮细胞生长抑制因子（APF）是一种由9个氨基酸与半乳糖相连的热稳定、小分子量多肽，主要存在于间质性膀胱炎患者的尿液中，由病变的膀胱移行细胞产生和分泌，具有强烈的抗膀胱上皮细胞生长的作用［1~7］。

另有研究发现，APF还具有抗膀胱肿瘤细胞生长的作用，该作用可能与其抑制AP-1和HB-EGF的表达有关。AP-1是一种细胞活性因子，是由Jun-Jun，Jun-Fos，或Jun-Atf家族蛋白组成的同源或异源二聚体。AP-1属于基本的亮氨酸拉链转录因子［8］，通过在启动子区与特异AP-1 DNA连接位点连接［9］，调节靶基因的表达，从而影响细胞的增殖、分化、炎症、宿主反应及恶变。APF作用细胞后，其c-Jun的表达水平明显下降，导致AP-1的整体水平下降，活性降低，影响抑癌基因p53及细胞周期调控基因p21WAF1/CIP1的表达，抑制细胞生长［10］。HB-EGF能够通过自分泌调节人类膀胱上皮细胞生长，同时对于膀胱肿瘤也有较强的促增生作用。在人膀胱癌细胞中，HB-EGF通过结合表皮生长因子受体酪氨酸激酶而触发不同的生物反应，从而激活ErK/MARK途径［11］，APF 则可以激活 p38/MAPK 途径［13］。有关学者在对间质性膀胱炎的病因研究中发现，APF具有强烈的抑制HB-EGF功能及分泌的作用［1］，它能够抑制HB-EGF引起的ErK/MARK磷酸化的激活［12］，从而影响膀胱肿瘤细胞的生长及增殖。

本研究采用MTT方法检测了不同浓度有活性APF及无活性APF对人膀胱癌T-24细胞生长及增殖的影响。结果显示，有活性APF对膀胱肿瘤细胞的生长具有抑制作用，而无活性APF则对膀胱肿瘤细胞的生长无明显抑制作用。Western blot结果显示，加入无活性 APF 0 μg/ml、0.5 μg/ml、1.0 μg/ml细胞的c-Jun与HB-EGF的蛋白表达水平无显著差别，而有活性APF 0.5μg/ml组、1.0μg/ml组的c-Jun、HB-EGF蛋白表达水平，与上述4组比较，有明显的减低，且有活性APF 1.0μg/ml组比0.5μg/ml组的减低更显著，说明c-Jun与HB-EGF两者的蛋白表达随加入有活性APF剂量的增加而减低。以上结果提示，加入的有活性APF抑制了人膀胱癌T-24细胞c-Jun与HB-EGF的蛋白表达与生长，而无活性的APF则无此作用。

［1］Keay S，Zhang CO，Chai T，et al.Antiproliferative factor，heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor，and epidermal growth factor in men with interstitial cystitis versus chronic pelvic pain syndrome［J］.Urology，2004，63（1）：22-26.

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