长春碱对RAW264.7细胞增殖和分泌一氧化氮的影响

2010-05-22南华大学附属南华医院衡阳市421002

中国药房 2010年9期

仇燕（南华大学附属南华医院，衡阳市 421002）

长春碱（Vinblastine，VBL）是一种二聚吲哚类生物碱，属于长春碱类化合物。长春碱于1958年从长春花中提取出来，1970年后被广泛应用于临床肿瘤的治疗中，具有良好的抑制多种恶性肿瘤生长的作用，用于如何杰金氏病、绒毛膜上皮癌、急性白血病、乳腺癌和口咽部癌等的治疗中[1]。有关长春碱的研究虽报道较多，但有关其在免疫学方面的研究罕见报道。固有免疫是免疫系统的第一道防护线，而巨噬细胞在固有免疫应答中起着重要的作用[2]。故笔者以巨噬细胞（RAW264.7细胞）增殖和分泌一氧化氮（NO）等细胞行为变化为靶点，研究长春碱对其的影响，以为筛选和开发新型免疫调节药提供新策略。

1 材料

1.1 试药

脂多糖（LPS）、二甲基亚砜（DMSO）、MTT、碘化丙啶（PI）、抗β肌动蛋白单克隆抗体（Anti-beta-actin mAb）、抗鼠细胞周期蛋白B1单克隆抗体（Anti-mouse cyclin B1 mAb）、辣根过氧化酶标志的羊抗鼠IgG（HRP-goat Anti-mouse IgG）和长春碱（批号：V1377，纯度：≥96%）均由美国Sigma公司提供；DMEM培养基低糖（干粉）和胎牛血清均由美国Gibco-BRL公司提供；Griess检测试剂盒（美国Promega公司）；凯基Super ECL检测液（南京凯基生物科技发展有限公司）；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞

RAW264.7细胞系购自武汉大学典型培养物保藏中心。

1.3 仪器

680型酶标仪、PowerPac Basic型电泳仪（美国Bio-RAD公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；IX70倒置显微镜（日本Olympus公司）；2300型CO2细胞培养箱（美国Sheldon公司）；SW-CJ-IF型洁净工作台（苏州净化设备厂）；Megafuge 1.0R型低温离心机（德国Herculeus公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

取RAW264.7细胞于DMEM培养基中培养至对数生长期，用 0.25%胰酶消化液消化，离心（125 r·min－1，5 min，20℃），调整细胞密度为每升5×108个，并接种于96孔细胞培养板，每孔定容200 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。

2.2 MTT法检测长春碱对RAW264.7细胞增殖的影响

试验分为对照组（含0.01%DMSO的DMEM 10 μL）和实验组，即长春碱低、中、高浓度（50、100、150 μmol·L－1）组。取“2.1”项培养24 h后的细胞，每孔加入10 μL不同浓度的VBL（终浓度分别为50、100、150 μmol·L－1），每一浓度设3个复孔，于37℃、5%CO2培养箱培养48 h。每孔加入20 μL MTT工作液，于37 ℃、5%CO2培养箱孵育4 h，离心（300 r·min－1，5 min），吸掉上清液体，每孔加入100 μL DMSO，振荡器上振荡10 min，酶标仪540 nm波长检测吸光度（A）值，并计算细胞相对抑制率。细胞相对抑制率＝（1－实验组A均值/对照组A均值）×100%。

2.3 流式细胞术检测细胞周期分布

试验分组和药物的处理同“2.2”项，48 h后收集细胞，用冷的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤，离心（125 r·min－1，5 min，4℃），用300 μL PBS重悬（含10%普通级小牛血清），加入700 μL冷无水乙醇，4℃固定30 min，冷PBS重悬洗涤细胞2次，加入300 μL PI染液（含RNase），避光15 min，立即进行流式细胞术检测，并以ModFit软件分析，拟合计算各时相细胞的百分比。

2.4 Western blot法检测cyclin B1的表达情况

试验分组和药物的处理同“2.2”项，48 h后收集细胞，PBS洗涤2次，裂解，离心，收集上清液，即细胞总蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白，调正蛋白浓度，用等量蛋白和蛋白上样缓冲液混合，煮沸，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后转硝酸纤维素膜（NC膜），依次孵抗体，即抗鼠细胞周期蛋白B1单克隆抗体和辣根过氧化酶标志的羊抗鼠IgG，用ECL检测液发光，并显影定影，最后用Quantity one分析软件计算条带灰度。

2.5 Griess试剂盒检测NO分泌

试验分为对照组、LPS 组、LPS+长春碱（50、100、150 μmol·L－1）组。取“2.1”项培养24 h 后的细胞，每孔加10 μL 不同浓度的长春碱（终浓度分别为50、100、150 μmol·L－1），每一浓度设3个复孔，于37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，加入LPS（终浓度10 mg·L－1）继续培养。24 h后，按照试剂盒说明书操作并制备NO标准曲线，用校准曲线确定试验各组NO的分泌量。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 长春碱对RAW264.7细胞增殖的影响

MTT法检测RAW264.7细胞增殖的结果详见表1。

根据MTT的工作原理，A值与活细胞数量成正比。从表1中可以看出，随着长春碱浓度的升高，A值逐渐下下降，说明RAW264.7细胞的增殖受抑程度增强，具有浓度依赖性（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组细胞相对抑制率结果（，n＝3）Tab 1 Relative inhibition of cells in each group（，n＝3）

与对照组比较：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，#P＜0.01

A组别对照组长春碱50 μmol·L－1组长春碱100 μmol·L－1组长春碱150 μmol·L－1组3.010±0.0952.512±0.066＊1.933±0.048#1.150±0.017#细胞相对抑制率/%—16.535.861.8

3.2 长春碱对RAW264.7细胞细胞周期的阻断

流式细胞术检测长春碱对RAW264.7细胞细胞周期阻断的结果详见表2。

表2 各组细胞周期时相分布情况（，n＝3）Tab 2 Distribution of cycle phases of cells in each group（，n＝3）

与对照组比较：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，#P＜0.01

从表2中可见，随着长春碱浓度的升高，G2～M期细胞呈浓度依赖性增加，而G0～G1期和S期细胞则逐渐减少（P＜0.05，P＜0.01）。

3.3 长春碱对RAW264.7细胞表达cyclin B1的影响

Western blot法检测长春碱对RAW264.7细胞表达cyclin B1影响的结果详见图1。用Quantity One分析软件对图1进行灰度计算，并与β-actin比较，得到半定量结果，详见表3。

图1 各组细胞表达cyclin B1情况1.对照组；2.长春碱 50 μmol·L－1组；3.长春碱 100 μmol·L－1组；4.长春碱 150 μmol·L－1组Fig 1 Expression of cyclin B1 in each group1.control group；2.50 μmol·L－1vinblastine group；3.100 μmol·L－1 vinblastine group；4.150 μmol·L－1vinblastine group

表3 各组细胞表达cyclin B1的半定量结果Tab 3 Semi-quantitative analysis of the expression of cyclin B1 in each group

从图1和表3可见，对照组cyclin B1的条带最明显，其条带灰度比值为1.21，经50 μmol·L－1、100 μmol·L－1和150 μmol·L－1长春碱作用后，cyclin B1蛋白条带变浅，条带灰度比值也相应减少，并具有浓度依赖性。

3.4 长春碱对RAW264.7细胞分泌NO的影响

将一系列不同浓度的标准品与测定的对应A值作标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出NO量（Y）与A值的回归方程为Y＝0.024+0.009A（r＝0.998）。将不同组样品测得的A值代入该直线回归方程中，即得到相应的NO量，结果详见表4。

表4 各组细胞NO分泌量结果（，n＝3）Tab 4 Result of NO secretion of cells in each group（，n＝3）

与对照组比较：※P＜0.01；与LPS组比较：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：※P＜0.01；vs.LPS group：＊P＜0.05，#P＜0.01

NO分泌量/nmol·L－1 1.70±0.3220.38±3.15※15.21±2.36＊12.56±1.98#7.12±2.87#组别对照组LPS组LPS+长春碱50 μmol·L－1组LPS+长春碱100 μmol·L－1组LPS+长春碱150 μmol·L－1组

从表4可见，经LPS刺激，RAW264.7细胞大量分泌NO（P＜0.01）；但随着长春碱浓度的升高，LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO的量逐渐减少，并具有浓度依赖性（P＜0.05或P＜0.01）。

4 讨论

微管骨架是一个动态网络，由微管蛋白的结合与分离维持细胞的动态变化，如细胞的分裂和增殖[3]。多年的研究表明，长春碱通过与微管蛋白二聚体结合，抑制纺锤体的形成，使细胞分裂停滞在M期，从而最终抑制肿瘤细胞的生长[4]。本研究将长春碱作用于RAW264.7细胞，MTT检测结果表明，长春碱具有抑制RAW264.7细胞增殖的作用；而PI染色检测细胞周期分布的结果进一步表明，长春碱使RAW264.7细胞停滞于G2～M期，这恰好与前人的研究结果[4]相一致。

细胞周期是由细胞周期蛋白（cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）共同驱动的。不同类型的cyclin随细胞周期进程在不同的时相出现，依次激活相应的CDK，驱动细胞完成由G1→S→G2→M的转换，然后被降解[5]。在众多cyclin中，cyclin B1在推动细胞进入G2～M期中起着关键性的作用。研究表明，cyclin B1从G1晚期开始表达，到G2后期达到高峰，M期中期被迅速降解。其高峰时活性最佳，并激活CDK1，推动细胞进入G2～M期[6]。本研究Western blot法结果表明，长春碱具有抑制RAW264.7细胞表达cyclin B1的作用。这可能是长春碱使RAW264.7细胞细胞周期停滞于G2～M期，抑制RAW264.7细胞增殖的分子机制之一。

NO是一种气体信号分子，能够进入细胞内，直接作用于相关酶，引起细胞的快速反应[7]。RAW264.7细胞来源于小鼠的巨噬细胞系，而巨噬细胞通过分泌细胞因子和吞噬异物，在天然免疫应答中起着重要的作用。被激活的巨噬细胞能够分泌NO，而NO是巨噬细胞发挥吞噬功能的基本条件。随着NO的减少，巨噬细胞的吞噬功能也相应地减弱[8]。本研究Griess试剂盒检测结果显示，长春碱能显著抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO，并具有浓度依赖性。这暗示着长春碱不但能够抑制RAW264.7细胞的增殖，还能抑制RAW264.7细胞的生物学功能。

本研究证明长春碱不但能抑制RAW264.7细胞表达cyclin B1，使细胞周期停滞于G2～M期，从而抑制了RAW264.7细胞的增殖，而且还能抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO，影响RAW264.7细胞的生物学行为。这不但丰富了长春碱的药理作用内容，还为将其开发成为免疫抑制药物提供了试验依据，故具有重要的临床应用和社会经济意义，但其具体机制有待进一步的研究。

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