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雷公藤甲素单次及多次给药对大鼠肝药酶活性的影响Δ

2010-05-22姚金成饶健曾令贵张陆勇江振洲何玲胡领赵绪元湖南省药品审评认证与不良反应监测中心长沙市400中国药科大学国家新药筛选中心南京市0009中南大学湘雅二医院长沙市400

中国药房 2010年11期
关键词:微粒体甲素雷公藤

姚金成,饶健,曾令贵#,张陆勇,江振洲,何玲,胡领,赵绪元(.湖南省药品审评认证与不良反应监测中心,长沙市 400;.中国药科大学国家新药筛选中心,南京市 0009;.中南大学湘雅二医院,长沙市 400)

雷公藤是近半个世纪以来发生中毒事件最多的中草药之一,其毒性在传统中草药中排第三,全株均有不同程度的毒性。雷公藤属植物的化学成分非常复杂,迄今为止,已从雷公藤属植物中分离得到大约100种成分[1],其中二萜类是主要毒性成分,其次是生物碱类[2]。雷公藤甲素(Triptolide,又称雷公藤内酯醇)是从雷公藤中提取的一种环氧二萜内酯醇,是雷公藤中主要药理活性及毒性成分[3],其相关效价比雷公藤总苷高100~200倍[4],是评价雷公藤药材质量好坏的主要指标,也是目前雷公藤制剂质量控制标准的主要指标。

有较多的临床病例报道了雷公藤及其制剂所导致的肝毒性。本课题组的前期研究结果表明,较高剂量多次ig给予雷公藤甲素能导致大鼠较明显的肝毒性,那么这是否与影响肝药酶P450而导致其代谢减慢有关?鉴于目前尚未见有关雷公藤甲素对肝药酶P450影响的报道,故本研究拟探讨雷公藤甲素对肝药酶P450的影响,以期为临床安全、合理用药提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

680型酶标仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);752C型紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂);超速低温离心机(美国Beckman公司);T25型组织分散器(美国IKA公司);核酸电泳仪(北京市六一仪器厂);BS210S型电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 试药

雷公藤甲素原料药(中国医学科学院皮肤病研究所,纯度>96%);雷公藤甲素对照品(中国药品生物制品检定所,纯度>98%);BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);甲氧基异唑、乙氧基异唑、戊氧基异唑、牛血清白蛋白、Folin试剂、NADPH(美国Sigma公司);红霉素(上海生工生物工程有限公司);Anti-rabbit CYP3A,CYP2E1,β-actin ant-ibodies and HRP-conjugated goat anti-rabbit Ig(美国Santa Cruz公司);硝酸纤维素膜(美国Pall公司);丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(美国Roche公司);甘氨酸(上海生工生物工程有限公司);过硫酸胺(中国医药集团上海化学试剂公司);鲁米诺发光底物试剂盒(美国Pierce公司);其余试剂均为国产分析纯。

1.3 动物

SD大鼠48只,♀♂各半,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供(生产许可证号:SCXK(沪)2003-0004)。

2 方法

2.1 分组及给药

SD大鼠随机分为8组,即1 d组(包括溶剂对照(丙二醇生理盐水)及雷公藤甲素高、中、低剂量(450、300、150 μg·kg-1)组)和14 d组(包括溶剂对照(丙二醇生理盐水)及雷公藤甲素高、中、低剂量(450、300、150 μg·kg-1)组)。ig给药,每天1次。

2.2 大鼠肝微粒体的制备

SD大鼠禁食不禁水16 h,将大鼠断头处死并置冰板上,快速摘除肝脏,自门静脉注入0~4℃冰浴生理盐水,冲洗肝脏至土黄色,再用生理盐水将血水冲洗干净。将肝组织剪碎,采用差速离心法制备大鼠肝微粒体。具体操作方法为:先将肝匀浆在4 ℃以9000 r·min-1离心30 min,取上层,4 ℃下100000 r·min-1离心60 min,下层粉红色沉淀即为所需的肝微粒体;将沉淀物悬浮于含30%甘油的KCl-磷酸盐缓冲液中,置于-80℃冰箱内贮藏,采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。

2.3 含量测定

2.3.1 细胞色素P450含量测定:微粒体中P450含量按Omura法测定。将微粒体用KCl-磷酸盐缓冲溶液稀释成1.0 mg·mL-1,加入数毫克连二亚硫酸钠,混匀,1 min后等分到参照杯和样品杯中,在紫外分光光度仪上先扫描基线,然后在样品杯中通入CO约1 min,稳定5 min后在400~500 nm波长范围内扫描,记录450和480 nm波长处的吸光度(A),按以下公式计算P450含量:P450(nmol·mg-1)=ΔA(450nm-480nm)×1000(91×微粒体蛋白浓度)。

2.3.2 细胞色素b5含量测定:将微粒体用KCl-磷酸盐缓冲溶液稀释成1.0 mg·mL-1,等分到参照杯和样品杯中,在紫外分光光度仪上先扫描基线,然后在样品池中加入数毫克连二亚硫酸钠,混匀,在400~500 nm波长范围内扫描,记录423和500 nm波长处的A,按以下公式计算b5含量:b5(nmol·mg-1)=ΔA(423nm-500nm)×1000/(171×微粒体蛋白浓度)。

2.4 红霉素N-去甲基酶(ERD)活性测定

参考相关文献[5]进行测定。

2.5 二甲基亚硝胺脱甲基酶(NDMA)活性测定

在空白管、标准管及样品管中分别加入0.25 mL Tris-HCl缓冲液、0.15 mL蒸馏水、适量微粒体,使最终体积为0.5 mL,反应液中含0.5 mg微粒体蛋白。样品管中加入0.05 mL NDMA(100 mmol-1·L-1),标准管中加入10 μL甲醛溶液(3.33 mmol·L-1)。将以上各管放入37℃水浴中,预温孵1 min,然后加入NADPH发生系统以起始反应,温孵20 min,用0.05 mL ZnSO(425%)终止反应,立即混匀后加入0.05 mL饱和Ba(OH)2,2500 r·min-1离心20 min,分别取0.35 mL上清液,加入0.15 mL Nash试剂,混匀后放入50℃水浴中温孵30 min,冷却后加样于96孔板上,用酶标仪在412 nm波长处测定A。

2.6 甲氧基异噁唑脱甲基酶(MROD)、乙氧基异噁唑脱乙基酶(EROD)、戊氧基异噁唑脱烷基酶(PROD)活性测定

反应体系为肝微粒体100 μg、0.1 mol·L-1Tris缓冲液500 μL,甲氧基异唑2.5 μL,加重蒸水至900 μL,37 ℃水浴预孵5 min,加10 mmol·L-1NADPH液100 μL,空白管用重蒸水代替NADPH。37℃振荡孵育20 min,各管加100 μL冰冷丙酮终止反应,稍加离心,然后在530 nm波长处测定荧光值(F)。各管均设对照管,根据标准曲线计算异唑的浓度。

2.7 Western blotting法检测大鼠肝微粒体CYP3A及CYP2E1蛋白的表达

样品经过相应处理后,参照本课题组前期研究中Western blotting部分[5],换相应抗体后实验方法做适当改变。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 雷公藤甲素对肝微粒体中细胞色素P450及b5含量的影响

14 d雷公藤甲素中剂量组在8 d有1只大鼠死亡,14 d雷公藤甲素高剂量组在7、11 d各有1只大鼠死亡。与溶剂对照组比较,雷公藤甲素高、中、低剂量组给药1 d及14 d后,对细胞色素P450及b5含量无影响(P>0.05)。雷公藤甲素对肝微粒体中细胞色素P450及b5含量的影响见表1。

表1 雷公藤甲素对肝微粒体中细胞色素P450及b5含量的影响()Tab 1 Effects of triptolide on the content of cytochrome P450 and b5 in rat liver microsom(e)

表1 雷公藤甲素对肝微粒体中细胞色素P450及b5含量的影响()Tab 1 Effects of triptolide on the content of cytochrome P450 and b5 in rat liver microsom(e)

细胞色素b5含量/nmol·mg-1 0.55±0.0670.53±0.240.46±0.0790.63±0.250.59±0.170.55±0.130.67±0.230.23±0.12组别1 d溶剂对照组1 d雷公藤甲素低剂量组1 d雷公藤甲素中剂量组1 d雷公藤甲素高剂量组14 d溶剂对照组14 d雷公藤甲素低剂量组14 d雷公藤甲素中剂量组14 d雷公藤甲素高剂量组剂量/μg·kg-1-150300450-150300450细胞色素P450含量/nmol·mg-1 0.53±0.140.59±0.110.48±0.160.56±0.150.56±0.270.63±0.230.55±0.240.49±0.17

3.2 雷公藤甲素对肝微粒体中ERD活性的影响

与溶剂对照组比较,1 d雷公藤甲素高、中、低剂量组ERD活性无显著变化(P>0.05);14 d雷公藤甲素高剂量组ERD活性显著减弱(P<0.05)。ERD活力反映CYP3A的活性,据此初步推断高剂量组给药14 d后,对CYP3A酶活力具有一定的抑制作用。雷公藤甲素对肝微粒体中ERD活性的影响见表2。

3.3 雷公藤甲素对肝微粒体中NDMA活性的影响

与溶剂对照组比较,1 d雷公藤甲素高、中、低剂量组NDMA活性无显著变化(P>0.05);14 d雷公藤甲素中剂量组NDMA活性略微下降(P>0.05);14 d雷公藤甲素高剂量组NDMA活性显著降低(P<0.05)。NDMA活力反映CYP2E1的活性,据此初步推断雷公藤甲素高剂量组给药14 d后,对CYP2E1酶活力具有一定诱导作用。雷公藤甲素对肝微粒体中NDMA活性的影响见表3。

表2 雷公藤甲素对肝微粒体中ERD活性的影响()Tab 2 Effects of triptolide on the activity of ERD in rat liver microsom(e)

表2 雷公藤甲素对肝微粒体中ERD活性的影响()Tab 2 Effects of triptolide on the activity of ERD in rat liver microsom(e)

与14 d溶剂对照组比较:*P<0.05vs.14 d solvent control group:*P<0.05

组别1 d溶剂对照组1 d雷公藤甲素低剂量组1 d雷公藤甲素中剂量组1 d雷公藤甲素高剂量组14 d溶剂对照组14 d雷公藤甲素低剂量组14 d雷公藤甲素中剂量组14 d雷公藤甲素高剂量组ERD活性/nmol·mg-1 0.74±0.250.61±0.160.85±0.150.78±0.240.87±0.220.74±0.170.66±0.190.43±0.14*剂量/μg·kg-1-150300450-150300450

表3 雷公藤甲素对肝微粒体中NDMA活性的影响()Tab 3 Effects of triptolide on the activity of NDMA in rat liver microsom(e)

表3 雷公藤甲素对肝微粒体中NDMA活性的影响()Tab 3 Effects of triptolide on the activity of NDMA in rat liver microsom(e)

与14 d溶剂对照组比较:*P<0.05vs.14 d solvent control group:*P<0.05

组别1 d溶剂对照组1 d雷公藤甲素低剂量组1 d雷公藤甲素中剂量组1 d雷公藤甲素高剂量组14 d溶剂对照组14 d雷公藤甲素低剂量组14 d雷公藤甲素中剂量组14 d雷公藤甲素高剂量组剂量/μg·kg-1-150300450-150300450 NDMA活性/nmol·mg-1 4.73±0.714.97±0.623.96±0.684.14±0.774.49±0.964.73±0.856.55±1.488.24±1.62*

3.4 雷公藤甲素对肝微粒体中MROD、EROD、PROD活性的影响

与溶剂对照组比较,1 d及14 d雷公藤甲素高、中、低剂量组MROD、EROD、PROD活性无显著差异(P>0.05)。雷公藤甲素对肝微粒体中MROD、EROD、PROD活性的影响见表4。

表4 雷公藤甲素对肝微粒体中MROD、EROD、PROD活性的影响()Tab 4 Effects of triptolide on the activity of MROD,EROD and PROD in rat liver microsom(e)

表4 雷公藤甲素对肝微粒体中MROD、EROD、PROD活性的影响()Tab 4 Effects of triptolide on the activity of MROD,EROD and PROD in rat liver microsom(e)

组别1 d溶剂对照组1 d雷公藤甲素低剂量组1 d雷公藤甲素中剂量组1 d雷公藤甲素高剂量组14 d溶剂对照组14 d雷公藤甲素低剂量组14 d雷公藤甲素中剂量组14 d雷公藤甲素高剂量组剂量/μg·kg-1-150300450-150300450 MROD活性/pmol·mg-1 4.71±0.874.95±0.614.74±0.685.17±0.554.63±0.823.87±0.774.24±0.754.70±0.93 EROD活性/nmol·mg-1 14.3±3.1112.8±2.2311.5±1.7916.8±2.6413.7±1.9813.8±2.3916.4±3.3115.7±2.77 PROD活性/nmol·mg-1 2.39±0.642.04±0.381.95±0.442.87±0.732.51±0.672.14±0.472.85±0.612.92±0.83

3.5 雷公藤甲素对大鼠肝微粒体CYP3A及CYP2E1蛋白表达的影响

雷公藤甲素高、中、低剂量组给药1 d后,对CYP3A及CYP2E1蛋白的表达无影响(P>0.05);雷公藤甲素中、低剂量组给药14 d后,对CYP3A及CYP2E1蛋白的表达无影响(P>0.05);雷公藤甲素高剂量组给药14 d后,对CYP2E1蛋白的表达虽然有所增加,但与溶剂对照组比较无显著差异(P>0.05);雷公藤甲素高剂量组给药14 d后,对CYP3A蛋白的表达有显著抑制作用(P<0.05)。雷公藤甲素对肝微粒体中CYP3A及CYP2E1蛋白表达的影响见图1。

4 讨论

CYP2E1在肝脏中占CYP450s总量的7%[6],是CYP450s中的重要成分,是许多低分子有机化合物及药物在体内的主要代谢酶(如乙醇、蒽氟烷、氯唑沙宗、对乙酰氨基酚等),烟草中的许多成分也通过CYP2E1在体内进行生物转化[7]。由于CYP2E1的活性存在个体和种族差异,其底物主要是人们经常接触的前致癌物和前毒物。本研究发现,雷公藤甲素高剂量组给药14 d后,对NDMA活性有明显诱导作用,与溶剂对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),提示高剂量的雷公藤甲素多次给药可能诱导CYP2E1酶活力。因此,临床上其它药物与其联合用药时要引起注意。

CYP3A酶的组成成员包括CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5(25%成人肝脏中存在)、CYP3A7(胚胎肝脏中存在),其中以CYP3A4在肝脏含量最为丰富,是成人肝脏中的主要表达酶,能代谢多种药物、内源性代谢产物、黄曲酶素B1和其它前致癌物,可参与近200种药物的体内代谢,约占全部药物的50%[8]。本研究表明,高剂量组给药14 d后,对CYP3A酶活力具有一定的抑制作用,提示雷公藤甲素可能与由CYP3A代谢的药物存在代谢性相互作用。由于雷公藤甲素具有抗炎、抗菌、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤活性,目前被广泛应用于类风湿性关节炎、肾炎、红斑狼疮及各种皮肤病等50多种疾病的治疗,其免疫抑制作用更是受到广泛重视,因此更加增加了其与其它药物合用的可能性。

药物的代谢性相互作用中,由酶的抑制而引起的相互作用约占全部相互作用的70%,酶的诱导引起的相互作用约占23%,其它则只占7%[9]。而药物间的代谢抑制一般被认为是一种潜在危险,应尽量加以避免,如氯霉素与抗凝药双香豆素合用时,可使双香豆素的代谢受阻而引起出血;酮康唑可以抑制特非那丁的代谢,使特非那丁的血药浓度大幅提高而导致致命性的室性心律失常。

主要由CYP3A4代谢的药物有大环类酯类抗生素、咪唑类抗真菌药物、抗病毒药、钙拮抗药、利福霉素类药物及胡柚汁等,这些药物与其它药物合用可能够诱导或抑制药物代谢酶的活性而影响疗效或出现严重不良反应[10~12]。另有研究表明,临床应用的免疫抑制剂主要经CYP3A4代谢[13,14],且治疗免疫系统疾病时,临床常采用多种药物联合治疗的方案。可见,研究雷公藤甲素对肝脏药物代谢酶活性的影响具有十分重要的临床意义。

图1 雷公藤甲素对肝微粒体中CYP3A及CYP2E1蛋白表达的影响A.图片;B.统计结果Fig 1 Effect of triptolide on the protein expression of CYP3Aand CYP2E1 in rat liver microsome.A.photograph;B.statisticod results

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