生姜醇提取物抗心肌缺血再灌注损伤的作用研究Δ

卢仁福，贾 科，侯朋远，吴庆琛(重庆医科大学附属第一医院胸心外科，重庆市 400016）

生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的新鲜根茎，既是食品又是临床广泛应用的传统中药，其性味辛温，具有解表散寒、温中止呕、行水解毒、化痰止咳之功效[1]。有关研究发现，生姜除具有抗血小板聚集、降低血脂和扩张血管、抗动脉粥样硬化等作用外，还具有抗缺氧、抗氧化作用，对人心肌细胞缺氧缺糖性损伤有保护作用[2～3]。研究表明[4～6]，在家兔急性完全性脑缺血再灌注模型中，生姜提取液有抗急性脑缺血再灌注损伤作用。而生姜醇提取物在心脏缺血再灌注的研究，国内、外还未曾报道。本研究旨在探讨生姜醇提取物对在体结扎大鼠抗急性局部心肌缺血再灌注损伤的作用及可能的作用机制，为生姜预处理在体外循环心脏手术中和冠心病急性心肌梗死有效恢复心肌血液灌注后心肌保护的临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

DH-140型动物人工呼吸机（浙江医科大学医学仪器实验厂）；3K30型高速冷冻离心机（Sigma公司）；DK-8D型电热恒温水箱（上海精宏实验有限公司）；722型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；BL-420E型生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；600型透射电镜（日本日立公司）。

1.2 试药

生姜醇提取物（西安天一生物技术有限公司，批号：TYG060326）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD大鼠50只，鼠龄11周，♀，体质量250～300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物许可证号：SCXK（渝）2007-0001）。

2 方法

2.1 模型的复制

大鼠称重，ip 10%乌拉坦（6 mL·kg-1）麻醉后固定于手术台。颈部去毛，切开皮肤，分离颈前肌，暴露气管，气管切开后插管（由一次性塑料滴管制作），接动物人工呼吸机行机械通气（潮气量40 mL·kg-1，吸气∶呼气＝1∶1.5），于呼气末持续正压通气。双前肢及右后肢接生物机能实验系统记录标准Ⅱ导联心电图，电脑全程实时记录心电图变化。胸骨旁行一0.7 cm切口开胸，暴露心脏，左心耳和肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉，在左心耳下方2 mm处以5～0无损伤缝合针穿线，进针深度为1.0～1.5 mm，宽度为2～3 mm，用一细小硅胶管垫于血管和结扎线之间结扎左冠状动脉前降支，缺血再灌注方法及判断标准按文献[7]，即结扎后结扎线下方心肌颜色变紫绀、5～15 min心电图显示T波高耸或倒置为结扎成功；再灌注时松开结扎线，心肌颜色逐渐恢复红润为再灌注成功。

2.2 分组及给药

将SD大鼠随机分成5组，即假手术（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）及生姜醇提取物高、中、低剂量（400、300、200 mg·kg-1）组。ig给药，每天1次，连续6周。最后一天ig后1 h开始复制模型，其中模型及生姜醇提取物高、中、低剂量组大鼠均行左冠状动脉前降支结扎缺血30 min，再灌注90 min；假手术组只行左冠状动脉前降支穿线，但不结扎。

2.3 指标的测定

再灌注实验结束后迅速剪下心脏，生理盐水反复冲洗血迹后剪下左室前壁梗死部位，固定位置一部分心肌做透射电镜，余固定位置的一部分心肌置液氮贮藏。

2.3.1 心肌细胞超微结构检查：心肌组织离体后1～2 min内，取左室前壁梗死部相同心肌部位4～5块（组织大小1 mm3），放入3%戊二醛中固定，经脱水、包埋、超薄切片，染色后做透射电镜检查。

2.3.2 心肌组织匀浆MDA含量测定：准确称取心肌组织，按质量体积比加9倍生理盐水，在低温冰水下用玻璃研磨器研磨制成10%心肌组织匀浆，离心，取上清液，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，用硫代巴比妥酸显色法测定心肌组织匀浆MDA含量。

2.3.3 心肌组织匀浆SOD活性测定：准确称取心肌组织，按质量体积比加99倍生理盐水，制成1%心肌组织匀浆，离心，取上清液，用黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织匀浆SOD活性。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 心肌细胞超微结构检查

假手术组大鼠心肌细胞膜基本完整，线粒体膜基本完整；模型组大鼠心肌细胞破坏严重，呈坏死性改变，线粒体分布紊乱肿胀，膜破裂，Z线不清，排列紊乱、模糊不清，线粒体中重度溶解，甚至大片空泡化；生姜醇提取物高、中、低剂量组大鼠心肌损伤程度较模型组明显改善，肌原纤维排列基本整齐规则，肌丝稀疏，少数线粒体轻度肿胀。透射电镜下大鼠心肌细胞超微结构见图1。

3.2 心肌组织匀浆MDA含量、SOD活性的测定

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织MDA含量显著升高（P＜0.01），SOD活性则显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，生姜醇提取物高、中、低剂量组大鼠心肌组织MDA含量显著降低（P＜0.01），而SOD活性显著升高（P＜0.01），随着生姜醇提取物剂量增加，无剂量依赖现象。生姜醇提取物对大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影响见表1。

图1 透射电镜下大鼠心肌细胞超微结构A.假手术组；B.模型组；C.生姜醇提取物低剂量组；D.生姜醇提取物中剂量组；E.生姜醇提取物高剂量组Fig 1 Ultrastructure of myocardial cells under TEMA.sham group；B.model group；C.low-dose ethanol extract of Z.officinale group；D.medium-dose ethanol extract of Z.officinale group；E.high-dose ethanol extract of Z.officinale group

表1 生姜醇提取物对模型大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影响（，n＝10）Tab 1 Effects of ethanol extract of Z.officinale on the content of MDA and activity of SOD in myocardial ischemia-reperfusion rats（，n＝10）

表1 生姜醇提取物对模型大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影响（，n＝10）Tab 1 Effects of ethanol extract of Z.officinale on the content of MDA and activity of SOD in myocardial ischemia-reperfusion rats（，n＝10）

与假手术组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01vs.sham group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

4 讨论

心肌缺血再灌注损伤发生机制尚未完全阐明，目前认为主要与氧自由基的产生、生物膜脂质过氧化、钙超载等相关[8～13]。在正常情况下，氧自由基（OFR）可以被内源性自由基清除剂如SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等清除，使得细胞免受氧自由基的毒性损伤。心肌缺血再灌注后，机体主要通过黄嘌呤氧化酶途径产生大量氧自由基，主要以羟自由基（OH-）的形式通过攻击膜组分磷脂中的不饱和脂肪酸，引发一系列自由基链式反应，生成多种脂质过氧化物，并引起细胞内钙超负荷，从而进一步导致细胞结构和功能的一系列损害。MDA作为脂质过氧化反应的产物，其含量不仅反映了脂质过氧化程度，也间接反映体内氧自由基的代谢状况和机体细胞受自由基损害的程度[14]。SOD作为体内清除氧自由基重要的酶之一，其活性高低反映了清除氧自由基的能力。本研究中生姜醇提取物高、中、低剂量组大鼠心肌组织MDA含量显著降低（P＜0.01），SOD活性显著升高（P＜0.01），提示生姜醇提取物能降低心肌缺血再灌注损伤后的脂质过氧化程度，增强清除氧自由基能力，从而减轻心肌细胞结构和功能的损害，且随着生姜醇剂量的增加，无剂量依赖关系。

心肌细胞超微结构改变是反映细胞损伤最直观的指标[15]。线粒体是细胞清除氧自由基、进行呼吸作用和能量转换的重要场所，其提供的能量是细胞生命活动的保证，其结构和功能的完整性是反映心肌损伤的敏感指标[16]。同时，线粒体是决定细胞损伤程度及显示损伤能否可逆的关键细胞器，也是清除破坏力极大的氧自由基酶系统活力最重要的部位，具有维持活体细胞生化氧化和能量产生的重要功能。本研究中心肌细胞超微结构显示，生姜醇提取物高、中、低剂量组心肌损伤程度较模型组显著改善，线粒体破坏较小，说明生姜醇提取物可有效保护线粒体，从而增加清除氧自由基的场所和能量，增强清除氧自由基的能力，减轻脂质过氧化的程度，进而保护心肌细胞。

生姜醇提取物为生姜经乙醇提取后的主要物质，主要为姜辣素，可分为姜酚类、姜烯酚类、姜酮类、姜二酮类和姜二醇类等不同类型，具有散寒解表、温中止吐、回阳通脉、燥湿消痰等功效。姜酚类、姜烯酚类、姜酮类、姜二酮类等业已证明有抗缺氧、抗清除自由基、抗脂质过氧化等多种药理作用。研究表明[5，17]，生姜醇提取物在肝脏、脑的急性缺血再灌注损伤中具有保护作用。本研究中，生姜醇提取物降低了缺血再灌注后的脂质过氧化程度，增强了清除氧自由基的能力，心肌超微结构显示生姜醇提物高、中、低组心肌细胞和线粒体破坏较小，减轻了缺血再灌注对心肌细胞及线粒体的损害，从而有效地保护了心肌细胞的结构和功能。本研究结果证实了生姜醇提取物在心肌缺血再灌注损伤中具有保护作用。其可能的作用机制是通过保护线粒体，增加清除氧自由基的场所和能量，增强清除氧自由基的能力，减轻脂质过氧化的程度，从而保护心肌细胞。

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