杠柳细胞悬浮培养体系的建立及有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量的测定

张 坚 ，高文远 ,2,，王 娟 ，赵志勇

（1.天津中医药大学中药学院，天津 300193；2.天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津 300457；3.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）

杠柳细胞悬浮培养体系的建立及有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量的测定

张 坚1，高文远1,2,3，王 娟3，赵志勇3

（1.天津中医药大学中药学院，天津 300193；2.天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津 300457；3.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）

[目的]建立杠柳细胞悬浮培养体系，并测定悬浮细胞中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量。[方法]无菌条件下切取杠柳幼根诱导愈伤组织，将其进行继代增殖培养，然后再将愈伤组织接种到液体培养基中建立细胞悬浮培养体系，并测定细胞中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量。[结果]建立了杠柳细胞悬浮培养体系，并测定了细胞中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量分别为4.06μg/g和1.92μg/g。[结论]通过组织培养方式可以成功建立杠柳细胞悬浮培养体系，细胞生长旺盛，但细胞中有效成分含量低，需要进一步对其基本培养基和培养条件进行考察。

杠柳；细胞悬浮培养体系；杠柳毒苷；4-甲氧基水杨醛

杠柳为萝藦科杠柳属植物杠柳，生于低山丘陵的沟谷、林缘、河边、荒坡灌丛中。分布东北、华北、西北等地。杠柳用途广泛，其根皮为传统中药香加皮，具有祛风湿、强筋骨的作用[1]。现代药理研究表明其根部具有强心苷、杠柳苷等活性成分，具有强心、抗肿瘤等多种活性[2]。长期以来香加皮作为传统中药，一直以根皮入药，未见通过细胞悬浮培养生产有药用价值的次生代谢产物的报道。故本实验通过建立杠柳细胞悬浮培养体系，生产其中有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛，是对传统中药香加皮扩大药源的一个新途径，同时也为今后杠柳细胞悬浮培养体系优化及工业化规模生产进行探索。

1 材料与方法

1.1 材料 杠柳种子采于天津蓟县山区。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理 取杠柳种子，去除种缨，流水冲洗2 h，后放入洗衣粉洗涤液中浸泡30m，并用玻璃棒不断的搅动，再在流水下冲洗1～2 h。将洗好的种子放入超净台上，以70%的乙醇中浸30 s，用无菌水冲洗2～3次，再用4%次氯酸钠（NaClO）浸泡30min并用玻璃棒不断搅动，后用无菌水冲洗5次，吸干材料表面水分后接种到无激素的MS固体培养基上。培养温度（25+1）℃，光照16 h/d，光照强度3 000～4 000 lx，蔗糖30 g/L，初始pH6.0。3 d左右杠柳种胚萌动，培养30 d胚芽可长高5 cm左右。取无菌苗，将根切成5mm左右的切段，备用。

1.2.2 愈伤组织的诱导与增殖 取无菌苗，将根切成5mm左右的切段，接入愈伤组织诱导培养基上（MS＋2，4－D（2，4－二氯苯氧基乙酸）2mg/L+BA（6-苄基腺嘌呤）1mg/L，蔗糖 30 g/L，初始 pH6.0，暗培养）1周左右可见根段膨胀，2周左右可见淡黄色疏松的愈伤组织产生，将生长旺盛，发育良好的愈伤组织细胞系接种到继代增殖培养基中（MS＋2，4－D1mg/L+BA0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，初始 pH6.0，暗培养），25 d继代1次，继代时选择生长良好、淡黄色、结构疏松、细胞团小、含水量大愈伤组织进行继代。

1.2.3 细胞悬浮培养体系的建立 将继代培养4～5代的愈伤组织接入到附加2，4-D1mg/L+BA0.5mg/L的MS液体培养基中在三角瓶内继代培养，摇床转速120 r/min。方法是挑选生长良好、疏松易碎的愈伤组织用镊子夹碎，接入到液体培养基中。最初2～3代，每代培养时间7d左右，继代时培养基过80目筛，筛除大颗粒，这样3～4代便可形成稳定、均一的单细胞和小细胞团的悬浮培养体系，以后的继代培养周期延长到15 d左右一代。

1.2.4 杠柳细胞悬浮培养体系中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量测定

1.2.4.1 色谱条件 HypersilODS2C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相为乙腈∶甲醇∶水（25∶10∶65）；柱温30℃；流速1mL/min；检测波长220 nm[3]

1.2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取杠柳毒苷1.2mg和4-甲氧基水杨醛2.4mg置于5mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得到杠柳毒苷0.24mg/L和4-甲氧基水杨醛0.48mg/L的对照品储备液。再分别取储备液 2.5、25、50、250、500、1 000 μL，甲醇定容于10mL容量瓶中，配置成不同浓度的对照品溶液。

1.2.4.3 供试品溶液的制备 取悬浮培养细胞，先抽滤除去培养液中的水分，然后在50℃烘箱中干燥至恒质量，取0.5 g加入40mL 50%乙醇，超声提取40 min后抽滤，将滤液浓缩至2 mL，微孔滤膜（0.22μm）过滤，备用。

2 结果

2.1 标准曲线 按照上述色谱条件进样20μL，以进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作线性回归，得杠柳毒苷回归方程为Y=15 693X-1 884.3，线性范围为0.06～24mg/L，相关系数R2=0.999 6；4-甲氧基水杨醛回归方程为Y=45 662X-5 334.3，线性范围为0.12～48 g/L，相关系数R2=0.999 3。

2.2 精密度实验 取样品供试液，平行进样6次，测得杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的峰面积，峰面积的相对平均标准差（RSD）分别为1.8%和2.1%。

2.3 重现性实验 取杠柳悬浮培养细胞按照样品测定方法平行操作6份，测得杠柳毒苷的平均含量为4.16μg/g，RSD为1.6%；4-甲氧基水杨醛的平均含量1.93μg/g，RSD为2.5%。

2.4 稳定性实验 取样品溶液在室温下放置0、2、4、6、8 h后分别测定，杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的RSD分别为2.2%和2.8%。表明本实验条件下样品溶液在8 h内稳定。

2.5 加样回收率实验 取已知杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量的杠柳悬浮培养细胞0.5 g（干质量），加入对照品杠柳毒苷（含量为6mg/L）和4-甲氧基水杨醛（含量为3mg/L）各400μL，制备供试品溶液，按照样品测定方法平行操作6份，结果杠柳毒苷平均回收率为102.8%，RSD为2.7%；4-甲氧基水杨醛平均回收率为99.4%，RSD为1.8%。

2.6 杠柳细胞悬浮培养物含量的测定 取杠柳悬浮细胞，按1.2.4.3制备供试品，以外标法计算杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的含量。测量结果见表1，图1。实验平行3次。

表1 样品测定结果（n=3）Tab.1 Determ ined Resultof Sam ples（n=3）

3 讨论

本实验中通过添加外源性激素2，4－D和BA成功的诱导出了杠柳根愈伤组织，愈伤组织淡黄色、生长迅速、结构疏松、易于分离。将此愈伤组织接入液体培养基中进行悬浮培养，经过5～7代即可形成由单细胞和小细胞团组成的杠柳细胞悬浮培养体系。实验中发现此培养条件下，悬浮培养细胞生长迅速，一个周期内（15 d左右）增殖速度为初始接种量的11倍以上，但有效成分含量较低，杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛仅为微克级，与文献[4-5]记载的有效成分含量（毫克级）差距较大，其主要原因可能是细胞高度脱分化抑制了次生代谢产物的积累。故如何提高细胞中次生代谢产物杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的含量，协调好细胞次生代谢产物的积累和细胞生长是下一步实验的重点，笔者将重点对基本培养基、培养条件以及外源性激素进行考察，并尝试通过添加诱导子及两步培养等方法提高细胞次生代谢产物的含量，以期获得杠柳高产细胞系。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1977,63:273-275.

[2]张援虎,王锋鹏.杠柳属植物化学成分研究进展[J].天然产物研究与开发,2003,15(2):157-161.

[3]任晓亮,刘 虹,戚爱棣.HPLC法同时测定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的方法改进[J].天津中医药,2007,24(3):252-253.

[4]李天祥,张丽娟,刘 虹,等.不同采收期、不同产地香加皮中4-甲氧基水杨醛的测定[J].中草药,2007,37(8):1256-1257.

[5]田俊生,李天祥.HPLC法测定不同产地香加皮中杠柳毒苷的含量[J].中药材,2006,29(8):799-800.

Establishmentof the cellsuspension culture system of perip loca sepium bunge and contentmeasurementof theeffective constituentof periplocin and 4-methoxysalicylaldehyde

ZHANG Jian1，GAOWen-yuan1,2,WANG Juan，etal
(1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of Scienceand Technology,Tianjin 300457,China)

[Objective]To establish the Cell Suspension Culture System of Periploca sepium Bunge and measure the constituent of Periplocin and 4-Methoxysalicylaldehyde.[Methods]Cutand collected the rootand induce callusunder sterile conditions.Then,propagate the callus for several cycles.Select eugonic and incompact callus and inoculate them to liquid medium to establish the System of Cell Suspension Culture.Then,measure the contentof Periplocin and 4-Methoxysalicylaldehyde in cell.[Results]The Cell Suspension Culture System of Periploca sepium bungewas established and the constituentof periplocin and 4-Methoxysalicylaldehydewasmeasured as 4.06μg/g and 1.92μg/g-respectively.[Conclusion]The Cell Suspension Culture System of Periploca sepium Bunge can be established successfully by tissue culture,but the effective constituentof the cellwas low,so itwas necessary to study theminimum medium and culture conditions further.

periploca sepium bunge；system ofcellsuspension culture；minimalmedium;periplocin；4-methoxysalicylaldehyde

R284.2

A

1672-1519(2010)02-0163-03

天津市科技支撑计划重点项目（09ZCKFSH01100）。

张 坚（1974-），男，博士，副教授，主要从事生药和组织培养工作。

高文远。

2009-10-20）