心脑血脉宁对家兔动脉粥样硬化易损斑块模型MMP-2、TIMP-2表达的影响*

郭茂娟，马东明，卢 斌，苏金玲，范英昌，姜希娟

（1.天津中医药大学实验教学部病理实验室，天津 300193；2.天津中医药大学病理教研室，天津 300193）

心脑血脉宁对家兔动脉粥样硬化易损斑块模型MMP-2、TIMP-2表达的影响*

郭茂娟1，马东明1，卢 斌1，苏金玲2，范英昌2，姜希娟2

（1.天津中医药大学实验教学部病理实验室，天津 300193；2.天津中医药大学病理教研室，天津 300193）

[目的]探讨心脑血脉宁对家兔动脉粥样硬化易损斑块模型基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）表达的影响。[方法]通过喂养高脂饲料和主动脉球囊内皮拉伤术复制动脉粥样硬化易损斑块模型，实验分为模型组，假手术组，心脑血脉宁组，历时15周。处死后，取腹主动脉行苏木精-伊红（HE）染色，观察镜下病变，计数斑块破裂数，免疫组化方法检测MMP-2、TIMP-2蛋白含量。[结果]1）HE观察：假手术组镜下形态结构完整，模型组斑块中心可见大量脂核，斑块表面覆盖纤维帽，在斑块肩部可见残存泡沫细胞和大炎细胞浸润。心脑血脉宁组介于两者之间。2）免疫组化结果：与假手术组相比，模型组MMP-2、TIMP-2蛋白含量明显升高，差异有显著性（P＜0.01）；心脑血脉宁组MMP-2与模型组比较表达降低，差异有显著性（P＜0.01），而TIMP-2含量与模型组相比有降低趋势，但无统计学差异（P＞0.05）；心脑血脉宁组能够有效降低两者比值，与模型组相比差异有显著性（P＜0.01）。[结论]心脑血脉宁干预家兔动脉粥样硬化易损斑块模型，能减少斑块破裂，其机制可能与降低斑块MMP-2含量以及调节MMP-2与TIMP-2比值有关。

心脑血脉宁；易损斑块；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶抑制因子-2

动脉粥样硬化（AS）引发急性冠脉综合征（ACS）是导致冠心病患者死亡的主要原因。近年来经过大量的临床及动物实验发现，易损斑块的存在是引起临床事件的罪魁祸首。这类斑块容易发生破裂继发附壁血栓形成或斑块内出血使得斑块体积迅速增大，造成恶性事件发生[1-2]。因此，如何稳定斑块成为研究热点。

心脑血脉宁临床上多年来用于治疗不稳定性心绞痛，且疗效显著，但是其作用机制尚未阐明，设想该复方的作用机制可能与稳定斑块有关，因此，以心脑血脉宁为研究对象，观察该复方能否稳定斑块，并观察心脑血脉宁对斑块稳定的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 纯系日本大耳白家兔40只，雄性，体质量1.7～2.0 kg，北京科宇动物养殖中心提供。饲养于天津中医药大学实验动物中心（环境设施符合《中华人民共和国卫生部实验动物标准》二级标准）。单笼饲养，自由饮水。

高脂饲料组成：胆固醇2%（天津市英博生化试剂有限公司批号：060619，含量＞98%）、新远牌大豆色拉油10%（秦皇岛金海食品有限公司），普通饲料88%（天津市武清区科达养殖中心提供）。

1.2 药物

1.2.1 受试药物 心脑血脉宁由天津市中医药研究院附属医院提供[批准文号：津药制字（2001）Z第0346 号]。成人服用剂量，1.6～2.4 g/次，3 次/d；组成：生黄芪、当归、川芎、赤芍、水蛭等。

1.2.2 实验药物 蝰蛇毒：广州蛇毒研究所；戊巴比妥钠：SIGMA分装；组胺：Fluka Chemie GmbH CH-9471Buchs；基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）一抗 博士德生物工程有限公司 批号分别为BA0576、BA0569；二抗、三抗：中国医学科学院生物医学工程研究所；DAB试剂盒：（ZLI-9032）北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验器材 输尿管导管：上海上医康鸽医用器材有限责任公司（规格：F4，生产批号050802）。球囊：天津市中拓乳胶厂（内径为0.9mm，长10 cm）显微镜、照相机 OLYMPUS微型涡旋混合器：上海沪西分析仪器厂XW-80AImage-Pro Plus6.0专业图像分析系统：美国Media Cybernetics公司。

1.4 实验动物分组及造模

1.4.1 实验动物及分组 40只家兔适应性饲养1周，测定血脂和体质量，依据血脂和体质量分为假手术组10只，模型组15只，心脑血脉宁组15只。假手术组饲以普通饲料，模型组：每天每只家兔给予50 g高脂饲料，再以普通饲料补足。心脑血脉宁组：造模完毕1周后，除保持和模型组同样饲养条件外，参照文献[3]，家兔灌服心脑血脉宁0.28 g/（kg·d），4周称量1次体质量，调整药物剂量，实验周期为15周。

1.4.2 药物触发 于处死动物前24 h和48 h给予两次药物触发，药物触发参考文献[2]的方法：以蝰蛇毒（RVV）0.15mg/kg腹膜下注射，30min后耳缘静脉注射组胺0.02mg/kg。

1.4.3 实验动物模型复制 模型组和心脑血脉宁组饲养2周高脂饲料后，行主动脉球囊内皮拉伤术，参照文献[1]方法进行：戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，固定，备皮。在无菌条件下，于兔股动脉搏动最明显处皮肤消毒，铺无菌洞巾，切开皮肤，分离组织，暴露股动脉，结扎远心端，近心端备用，动脉夹夹住近心端股动脉，靠近远心端结扎处作一动脉切口并导入4 F无菌球囊导管，放开动脉夹并收紧下方细线，局部压迫止血，将球囊导管插入15 cm左右，球囊用注射器推注10～15mL空气，往返回拉球囊3次损伤血管内皮，撤出导管和导丝，结扎股动脉并缝合伤口，术后10万U/kg青霉素肌注预防感染，连续7 d。术后继续饲以高脂饲料，普通饲料补足。假手术组麻醉固定，备皮，无菌条件下，于兔股动脉搏动最明显处皮肤消毒，铺无菌洞巾，切开皮肤，分离组织，暴露股动脉，不作动脉切口，直接缝合皮肤。

1.5 方法

1.5.1 苏木精-伊红（HE）染色 处死动物，取出自主动脉根部至髂总动脉分支处的主动脉，剥净外膜和周围脂肪，沿腹侧正中线纵向剪开，用0.9%的生理盐水冲洗干净，平铺于滤纸上，照相并计数斑块破裂情况，随即用中性甲醛溶液固定24 h以上，在主动脉弓下定位1 cm处，取材制石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察组织学改变。

1.5.2 易损斑块家兔模型主动脉斑块破裂的计数 在HE然色片中计数破裂斑块数目。破裂的斑块典型特征是：1）薄的纤维帽。2）较大的脂核。3）较多的炎细胞，特别是巨噬细胞浸润。

1.5.3 用免疫组化方法检测MMP-2、TIMP-2蛋白含量 光镜下每张切片于×400随机选取5个互不重叠视野，应用Image-Pro Plus6.0专业图像分析系统进行图像分析，测定每个视野的积分光密度值，取其平均值作为每张切片的结果。积分光密度数值大小反映了应用免疫组化方法所检测的蛋白表达量的多少。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。结果用均数±标准差（±s）表示，经正态性检验数据成正态分布，采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 兔主动脉病理形态学观察 假手术组的动脉内膜平坦完整，内皮细胞连续，中膜平滑肌排列规整，与弹力板平行。模型组的斑块中心可见大量脂质沉积形成的脂核，斑块表面覆盖薄的纤维帽，在斑块肩部可见残存的泡沫细胞和大量炎细胞浸润。心脑血脉宁组斑块中心可见脂质沉积形成的脂核，斑块表面覆盖较厚纤维帽，在斑块肩部少量炎细胞浸润。

2.2 观察并计数斑块破裂情况 HE染色观察易损斑块纤维帽厚度及炎细胞浸润程度。稳定斑块纤维帽平均厚度为0.44mm，而易损斑块平均厚度仅为0.13mm。心脑血脉宁对易损斑块模型家兔，药物触发后，模型组10只家兔中6只10处出现斑块破裂，而心脑血脉宁组有4只6处出现斑块破裂。提示心脑血脉宁有稳定易损斑块的作用。

2.3 心脑血脉宁对易损斑块模型家兔MMP-2/TIMP-2的影响 见表1。

表1 心脑血脉宁对易损斑块模型家兔主动脉MM P-2、TIMP-2表达影响(±s)Tab.1 Effectof Xinnao Xuemaining on expression of MMP-2 and TIMP in vulnerable plaque of rabbitwith atherosclerosis(±s)

表1 心脑血脉宁对易损斑块模型家兔主动脉MM P-2、TIMP-2表达影响(±s)Tab.1 Effectof Xinnao Xuemaining on expression of MMP-2 and TIMP in vulnerable plaque of rabbitwith atherosclerosis(±s)

注：与假手术组比较 ##P＜0.01；与模型组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。

组别假手术组模型组心脑血脉宁组10 MMP-2/TIMP-2 0.88±0.08 1.22±0.19##0.97±0.19*n 9 1 0 MMP-2光密度值（IOD）3864.56±821.14 10395.76±2003.92##7484.13±1115.37**TIMP光密度值（IOD）4 286.21±766.87 8 862.35±1 808.99##7 605.04±2 278.55

模型组MMP-2、TIMP-2蛋白含量明显升高，与假手术组相比，差异有显著性（P＜0.01）；心脑血脉宁组MMP-2与模型组比较表达降低，差异有显著性（P＜0.01），而TIMP-2含量与模型组相比有降低趋势，但差异无显著性（P＞0.05）；心脑血脉宁组能够有效降低两者比值，与模型组相比差异有显著性（P＜0.01）。

3 讨论

中药复方“心脑血脉宁片”（生黄芪、当归、川芎、赤芍、水蛭）为天津中医药研究院附属医院的院制剂，批准文号：津药制（字）2001ZD0346号，出自清朝王清任的《医林改错》中“补阳还五汤”。补阳还五汤由黄芪、当归、赤芍、川芎、红花、桃仁和地龙组成，用以治疗气虚血瘀为主的病证。

在动物体内复制AS动物模型方法较多且都比较成熟，但复制易损斑块破裂模型却非常困难，这主要与影响斑块破裂的因素多有关。目前建立斑块破裂方法主要有两类：1）寻找自发斑块破裂/血栓形成动物模型。2）主动诱发斑块破裂/血栓形成动物模型。本实验参照Ab ela等方法采用了球囊拉伤配合高脂饲料，复制易损斑块动物模型，周期较短，易于制作和成功，在目前缺乏AS斑块破裂动物模型“金标准”情况下，可较好地用于斑块破裂发生机制和筛选稳定斑块药物研究。

ACS多数是由于易损斑块破裂，导致局部血栓形成而造成血管闭塞或不完全闭塞。因此稳定斑块对防治ACS至关重要[3]。本实验通过对斑块破裂的计数，得出心脑血脉宁可以稳定易损斑块；HE染色结果提示，假手术组镜下结构完整，模型组在易损斑块肩部有大量炎细胞浸润，心脑血脉宁组炎细胞数目较模型组减少。此外，心脑血脉宁还能够通过增加易损斑块纤维帽厚度，增强易损斑块稳定性。

基质金属蛋白酶（MMPs）是能够降解细胞外基质，参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质的蛋白酶家族[4]，MMP-2主要由成纤维细胞、炎症细胞、心肌细胞等细胞合成与分泌[5]，易损斑块内聚集着大量炎性细胞，特别是巨噬细胞，可产生大量MMPs，降解纤维帽下的基质成分，使纤维帽变薄，易于破裂。TIMP-2可抑制MMP-2的活性，从而影响整个MMPs/TIMPs系统。TIMP通过阻碍MMP介导的内皮细胞移动，抑制基质中促血管生成因子的释放而使MMPs的降解作用局限化，因此MMPs与TIMPs相互之间的作用平衡，对动脉粥样硬化易损斑块的发展方向起着重要的作用[6]。本实验观察心脑血脉宁MMP-2，TIMP-2的表达，结果：心脑血脉宁可能通过降低细胞外基质中MMP-2表达，调整MMP-2/TIMP-2比值，说明心脑血脉宁可以适度地调节MMP活性，改善细胞外基质重构，减轻基质降解，增加斑块纤维帽的稳定性，稳定斑块。

[1]徐 浩,陈可冀.从对动脉粥样硬化认识转变看中西医结合的优势与切入点[J].中国中西医结合杂志,2007,27(1):5-7.

[2]梁 春,黄高忠,吴宗贵.稳定斑块-治疗急性冠状动脉综合征的新策略[J].中华老年心脑血管病杂志,2000,2(3):207-210.

[3]马焕云.动脉粥样硬化易损斑块的研究进展[J].新医学,2006,37(10):692-699.

[4]吴 旻,李玉光,闫纯英.基质金属蛋白酶和氧化应激在大鼠动脉粥样硬化中的表达[J].中国心血管病研究杂志,2007,5(1):55-57.

[5]周宪梁,孙 凯,李昭晖.基质金属蛋白酶与动脉粥样硬化斑块发生、发展的关系[J].中国比较医学杂志,2006,16(12):705-707.

[6]周一军,张 锦,李 莉,等.糖尿病患者动脉粥样硬化斑块内基质金属蛋白酶2和9与斑块稳定的关系[J].中国动脉硬化杂志,2005,13(1):69-72.

Expression ofMMP-2,TIMP-2 of vulnerable plaque in rabbitswith atherosclerosis treated with Xinnao Xuemaining

GUOMao-juan，MADong-ming，LUBin，atel
(Pathology Laboratory of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193,China)

[Objective]Toobserve the effectsof Xinnao Xuemaining on theexpression ofMMP-2,TIMP-2 of vulnerable plaque in rabbits with atherosclerosis.[Methods]The vulnerable atherosclerotic plaquemodelwas reproduced by operation on abdominalaorta endothelium for inducing sacculus pull injury with the foraging with high cholesterol lipid feeding.Rats were divided into three groups:model group,sham operation group and Xinnao Xuemaining group.The experiment lasted for 15 weeks.After killing at the end of experiment,the sample ofabdominalaortawas collected for HE staining andmicroscopic lesion examination,counting of the number of plaque rupture and detecting the protein content of MMP-2,TIMP-2 by immunohistochemistry.[Results]HE observation was found that in the sham-operated group themorphologic structure was intact.In the center ofmodel group a large number of lipid plaque coreswas seen.The plaquewas covered with fibrous cap,the shoulder patcheswere visible in the remnants of foam cells and large inflammatory cell infiltration exited.In Xinnao Xuemaininggroup thenumberof lipid plaque coreswasbetweenmodeland sham operation group.The results of immunohistochemicalstaining showed thatcompared with sham-operated group,the expression ofMMP-2,TIMP-2 inmodelgroup was significantly increased(P<0.01).Comparedwithmodelgroup theexpression ofMMP-2 in Xinnao Xuemaininggroup reduced significantly(P<0.01).The TIMP-2 levelswee lower,but therewasno statisticaldifference(P>0.05).Xinnao Xuemaining group can effectively reduce both the ratio ofMMP-2/TIMP-2 compared withmodelgroup(P<0.01).[Conclusion]In vulnerable plaque ofatherosclerotic rabbitmodel Xinnao Xuemaining group can reduce the plaque rupture,itsmechanismmay be related to reducing the expression ofMMP-2 and regulating the ratio ofMMP-2 and TIMP-2.

Xinnao Xuemaining;vulnerable plaque;MMP-2;TIMP-2

R285.5

A

1672-1519(2010)02-0150-03

天津市卫生局中西医结合专项基金的资助项目（023611611）。

郭茂娟（1980-），女，硕士，研究方向为中西医结合防治心脑疾病。

姜希娟。

2009-12-24）