心复康联合骨髓间充质干细胞移植对濒死心肌的保护作用*

李广斌，苏金玲，姜希娟，范英昌

（天津中医药大学基础医学院，天津 300193）

心复康联合骨髓间充质干细胞移植对濒死心肌的保护作用*

李广斌，苏金玲，姜希娟，范英昌

（天津中医药大学基础医学院，天津 300193）

[目的]探讨中药心复康联合骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植在大鼠急性心肌梗死后对濒死心肌的保护作用及其机制。[方法]经密度梯度离心联合贴壁筛选法培养并纯化BMSCs，采用冠状动脉结扎法建立大鼠急性心肌梗死模型，移植前以5-溴脱氧尿核苷（Brdu）对移植细胞进行标记，术后采用中药心复康灌胃联合干细胞移植治疗。治疗后2周处死动物，免疫组织化学方法检测心肌损伤区Brdu阳性移植细胞数、CD34+新生血管数和细胞增殖核抗原（PCNA）阳性心肌细胞数量。[结果]心复康联合干细胞移植治疗组移植细胞存活率增加（与细胞移植组比较P<0.05），梗死边缘区新生血管数量及PCNA阳性心肌细胞数量均有所增加（与细胞移植组比较P<0.05）。[结论]中药心复康联合干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后濒死心肌细胞有明显的保护作用，其机制可能与心复康联合干细胞移植能更有效的促进损伤区血管新生有关。

心复康；骨髓间充质干细胞；心肌梗死；血管新生

最近，中药联合骨髓干细胞移植治疗心肌梗死取得了令人鼓舞的进展，显示出中药在干细胞移植过程中存在的特有优势：毒副作用小，促进干细胞增殖、分化等[1-2]。本实验采用中药心复康干预骨髓间充质干细胞移植治疗实验性大鼠心肌梗死，以观察中药心复康联合干细胞移植对大鼠心肌梗死后梗死周边区域心肌的保护作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雄性，体质量150～250 g（军事医学科学院第四研究所动物实验中心）,LDMEM培养基（美国GIBCO公司），胎牛血清（FCS，美国Hyclone公司），胰蛋白酶（Difco），乙二胺四乙酸（EDTA，天津联星试剂公司），5-溴脱氧尿核苷BrdU（Sigma公司），CD34、细胞增殖核抗原（PCNA）免疫组化试剂盒（天津联星试剂公司），BrdU石蜡切片免疫组化试剂盒（天津市灏阳生物制品有限公司），中药心复康（天津中医药大学第一附属医院制剂室）。

1.2方法

1.2.1 BMSCs体外分离培养和BrdU标记 本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选法培养并纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs），该方法可获得较纯的BMSCs，Pittenger等用流式细胞仪检测培养的第1代、第2代BMSCs的均质性分别达到95%和98%[3]。

5-溴脱氧尿核苷（BrdU）标记：每日观察原代及传代的细胞生长状况，需加BrdU的培养瓶中预先加入0.5 cm×1.0 cm无菌玻片，当细胞铺满瓶底50%时加入BrdU溶液10μmol/L（BrdU 50mg；二甲基亚砜 0.8mL；水 1.2m L）分别孵育 24、48、72、96 h。取出玻片，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，4%多聚甲醛固定15min，进行Brdu免疫组化染色（严格按试剂盒说明进行）。

1.2.2 动物模型制备 同基因型雄性Wistar大鼠，190～210 g，乙醚吸入麻醉。颈部正中切口，插入气管套管，行呼气末正压通气，标准肢体Ⅱ导联记录心电图。在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，钝性剥离肌肉层，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2mm处用无创小圆针结扎左冠状动脉前降支。手术15min，心电图S-T段呈单向曲线，术后两周苏木精-伊红（HE）染色见明确梗死区示手术成功。

1.2.3 BMSCs移植 移植前48 h在培养液中加入终浓度为10μmol/L的Brdu对移植细胞进行标记。胰酶消化，PBS 反复冲洗、离心（1 500 r/min，5min）2次，加入PBS液调整细胞浓度为2×106个/L。治疗组手术结扎冠状动脉15min后，再次打开胸腔，暴露心脏，用结核菌素注射器吸取1mL细胞悬液，分别于结扎区和附近心肌组织分5点注射细胞，对照组和模型组注射相同剂量生理盐水，注射完毕后，关闭胸腔，并注射2 d青霉素。

1.2.4 动物分组 实验分为4组：假手术组（S组，n=10）：只开胸穿线，不结扎左冠状动脉前降支。模型组（AMI组，n=10）：开胸结扎左冠状动脉前降支。单纯细胞移植组（B 组，n=10）：手术后 15min，注射培养的BMSCs。中药联合细胞移植组（X+B组，n=10）：手术后15min移植培养的BMSCs，并按体表面积法计算中药剂量的10倍[81 g/（kg·d）]灌胃2周。

1.2.5 中药制备 将中药心复康（由西洋参、白术、枸杞子、女贞子、土鳖虫等组成）置于砂锅中，加入相当于药材体积5倍的自来水浸泡1～2h，煮沸30min，滤过药液，再加入3倍量的自来水继续煮沸20min，过滤，合并两次滤液，将药物浓缩至200mL备用。

1.3 指标检测 进行移植细胞存活率、新生微血管密度及PCNA阳性心肌细胞数检测。处死动物，以结扎线为标志，每隔3mm取大鼠心脏横断面，每只大鼠心脏取材3块组织，制成切片，免疫组织化学方法检测心梗区Brdu阳性移植细胞数、CD34+新生血管数和PCNA阳性心肌细胞数（操作按试剂盒说明进行）。Nikon光学显微镜400倍视野下,每个组织切片随机选取10个视野,取10个视野平均值。移植细胞计数Brdu（＋）细胞，CD34阳性的血管计数时，相互分离的内皮细胞、内皮细胞簇、内皮细胞条索均按1个微血管计数，管腔大于8个红细胞大小，且带有较厚肌层的血管则不予计数；计算PCNA阳性率时,光镜下没有细胞质的增殖核,不计算在PCNA阳性率之中[4]。

1.4 统计学方法 所有实验数据采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较用单因素方差分析，均数比较采用t检验。

2 实验结果

2.1 BMSCs分离和培养 分离接种的细胞镜下呈圆形，大小不一，数目较多，48 h后贴壁，8～9 d后大部分细胞变成长梭形，少部分呈多角形。此期的细胞生长迅速，互相连接。传代培养2～3代后，细胞形态变得较为一致，呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，集落之间相互靠近，融合后呈漩涡状。至培养的第12天左右细胞达到80%～90%融合，此时已传至第3代，细胞形态成较一致的长梭形。将此时细胞收集用于细胞移植实验。

2.2 BMSCs标记 骨髓间充质细胞培养至40%～50%贴壁时加BrdU，在培养过程中，BMSCs呈纺锤形,可以贴壁生长、增殖。第8天,培养瓶中几乎所有的细胞都呈纺锤形的间充质干细胞。各标记组均见BrdU阳性细胞，Brd U阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布。各组观察200个细胞，记录Brd U阳性细胞的数目。结果可见标记24、48、72 h各组之间细胞阳性数明显增加，笔者选用标记72 h作为最佳标记时间进行后续实验，标记率＞96%，能够满足实验需要。

2.3 各组大鼠梗死区域BrdU阳性移植细胞检查结果 与细胞移植组比较，心复康联合细胞移植组BrdU阳性细胞数有所增加（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠Brdu阳性细胞数的比较(±s)Tab.1 Com parison of cellamountof Brdu+in ratsof each group(±s)

表1 各组大鼠Brdu阳性细胞数的比较(±s)Tab.1 Com parison of cellamountof Brdu+in ratsof each group(±s)

注：与细胞移植组比较★P<0.05。

组别B组X+B组n 10 10个/高倍视野7.40±1.52 8.76±2.38★

2.4 各组大鼠梗死周边区域新生血管及PCNA阳性心肌细胞检查结果 与假手术组比较，各组PCNA阳性心肌细胞数量和新生血管数量均升高（P<0.01）；与模型组比较，单纯移植组PCNA阳性心肌细胞数量无统计学差异，心复康联合干细胞移植组PCNA阳性心肌细胞和新生血管数量升高，（P<0.05）；与移植组比较，心复康联合干细胞移植组PCNA阳性心肌细胞数及新生血管数量升高（P<0.05）。见表 2。

表2 各组大鼠PCNA阳性心肌细胞数量和新生血管数量的比较(±s)Tab.2 Com parison of cardiacmuscle amountof PCNA+and neonatalvesselsof cd34+in ratsof each group(±s)

表2 各组大鼠PCNA阳性心肌细胞数量和新生血管数量的比较(±s)Tab.2 Com parison of cardiacmuscle amountof PCNA+and neonatalvesselsof cd34+in ratsof each group(±s)

注：与假手术组比较※P<0.05，※※P<0.01 与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01；与细胞移植组比较★P<0.05。

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3 讨论

笔者的实验采用PCNA标记细胞的增殖，PCNA是酸性核蛋白，作为增殖细胞核抗原是真核细胞DNA合成所必须的一种核蛋白，PCNA在正常成年动物的心肌组织中没有表达，而在未成熟心肌和晚期衰竭心肌中有阳性表达[4]。

笔者的实验评价了不同处理方法后各实验组细胞增殖情况的差别，从结果来看联合治疗组PCNA阳性细胞数较模型组有所升高，并且大多数细胞形态接近于血管内皮细胞或成纤维细胞，其中,在梗死区及其边缘,大量的间质细胞PCNA阳性表达反映了血管新生和瘢痕形成。

从实验结果看，各治疗组均有PCNA阳性的心肌细胞出现，单纯细胞移植组PCNA阳性细胞数与模型组比较没有明显增多，而中药联合细胞移植组PCNA阳性心肌细胞数要多于单纯细胞移植组，说明中药在促进心肌细胞PCNA阳性表达方面占有优势。

笔者认为中药促进心肌细胞的修复和增殖中可能基于以下机制：一方面，心复康中的主要成分能够促进梗死周边区域血管新生，从而改善该区域血供，实验证实，联合治疗组新生血管数要高于单纯细胞移植组和模型组（P<0.05）。另一方面，心复康中主要成分如西洋参具有改善心功能，增加免疫，抗应激的作用，所含的皂苷有抗心律失常，抗心肌缺血，抗心肌氧化的作用；川芎所含的川芎嗪有保护心肌缺血损伤，降低心肌耗氧量的作用；丹参活血化瘀，所含的丹参酮ⅡA，有改善心肌缺血，对心肌梗死有保护作用，并能改善微循环。

心肌梗死属于中医“胸痹”“厥心痛”的范畴。《金匮要略》认为胸痹心痛的病机为“阳微阴弦”本虚标实。中药复方心复康以益气养阴，活血化瘀为根本大法，方中西洋参甘寒之品，补气养阴、清火生津；鹿衔草甘温补阳，微补肾阳、健脾理气；女贞子辛苦清凉，补中有清，滋而不腻，为补益肝肾之良药；丹参擅长活血化瘀，为活血化瘀的常用药；川芎味薄而气清，为阴中之阳，故能行血中之气；土鳖虫具破血逐瘀之力，其力猛而性温和。全方扶正祛邪，调和气血运行，从而使正胜邪去，气血盈畅，达到病去人安。笔者的实验证实心复康对移植BMSCs存在一定保护作用，其机制可能与促进心肌损伤区血管新生有关，这一结果为中药联合BMSCs移植治疗心肌梗死提供了一定的实验依据。

[1]卢新政,张晓友.人参皂苷Rg1对培养猪骨髓基质细胞增殖的影响[J].中国药理学通报,2003,19(3):353-354.

[2]祝晓玲,祝彼得.黄芪体外作用对贫血小鼠骨髓基质细胞分泌SCF的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2002,18(4):396-397.

[3]Pittenger C.,PittengerM.F.,Cahill K.S.,etal.Human Mesenchymal Stem Cells Differentiate to a Cardiomyocyte Phenotype in the Adult Murine[J].HeartCirculation,2002，105(1):93-98.

[4]李 灏,何建国.心力衰竭大鼠心肌细胞增殖与心功能的关系研究[J].中华医学杂志，2006，86（2）：102-105.

Protective action on im pending death cardiacmusclesby the therapy of traditionalChinesemedicine XinFuKang combined with transp lanted bonemesenchymalstem cells

LIGuang-bin， SU Jin-ling，JIANGXi-juan
（Tianjin University of TraditionalChineseMidicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To discuss the protective action on impending death cardiacmusclesby the therapy of traditionalChinesemedicine XinFuKang(XFK)combined with transplanted Bonemesenchymal stem cells（BMSCs） after rats acutemyocardial infarction.[Methods]BMSCswere cultured and purified by gradientcentrifugation-adhesivemethod.The ratswith acutemyocardial infarction were builted by coronary artery ligation.Before transplation,BMSCs were signed by Brdu,and after the OPS.of coronary artery ligation,the therapy methodewas XFK combining BMSCs transplantation.After2weeks,wemeasured cellamountof Brdu,neonatalvesselsofCD34 and the cardiacmuscle of PCNA around the infarctarea bymethod of IHC.[Results]Themethod of XFK combining BMSCs transplantation can increase livability of transplanted BMSCs,enhance the amount of neonatal vessel and PCNA cardiacmuscle around infarctarea(compared with group of BMSCs tranplation,P<0.05).[Conclusion]The therapy of XFK combined with BMSCs transplantation have better protection on the impending death cardiacmusclesaround the infarctarea,themechanism maybe the therapy can promote the vessels regeneration.

XinFuKang；BMSCs；Myocardial infarction；Vessel regeneration

R285.5

A

1672-1519(2010)01-0147-03

天津市卫生局中西医结合科研基金项目（03035）。

李广斌（1975-），男，硕士，讲师，主要从事心血管疾病研究及教学工作。

范英昌。

2009－08－20）