乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞INHB、FSHRmRNA及分泌功能的影响*

李 玲，金 哲，黄文玲，林佳静，蔡品均

（1.北京中医药大学临床医学院，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞INHB、FSHRmRNA及分泌功能的影响*

李 玲1，金 哲2，黄文玲2，林佳静1，蔡品均1

（1.北京中医药大学临床医学院，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

[目的]运用血清药理学方法观察乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞抑制素（INHB）、促卵泡激素受体（FSHR）mRNA的表达及其分泌功能的影响。[方法]在大鼠卵巢颗粒细胞培养体系中加入乌萸汤、尿促卵泡激素（FSH）及正常大鼠含药血清，培养48 h后，分别用酶联免疫吸附法（ELISA），逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及放免法测定颗粒细胞 INHB、FSHR、mRNA及培养液中雌二醇（E2）含量。[结果]各用药血清组E2含量较对照组均明显升高；颗粒细胞INHB、FSHRmRNA表达量明显增多，其中乌萸汤中剂量血清组效果优于西药组。[结论]乌萸汤含药血清能明显促进卵巢颗粒细胞INHB、FSHRmRNA的表达以及E2分泌，说明乌萸汤可以通过调控卵巢局部因子、增强FSHRmRNA的表达从而提高卵巢对促性腺激素的反应性，改善下丘脑-垂体-卵巢轴，促进E2的分泌，以促进卵泡发育成熟及排出。

乌萸汤；卵巢颗粒细胞；抑制素；促卵泡素受体；雌二醇

卵巢颗粒细胞（GC）是卵泡内主要的功能细胞之一，是雌激素和孕激素的主要来源细胞。GC的增殖和分化是卵泡不断发育和成熟的基本条件。本研究组前期的动物实验证明，补肾调肝方乌萸汤可提高卵巢储备功能，促进卵泡发育。本实验运用血清药理学原理，研究乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞分泌及促卵泡激素受体mRNA（FSHRmRNA）、抑制素（INHB）表达的影响，以进一步了解乌萸汤调节卵巢功能的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠25只，SPF级，6周龄，体质量（150±20）g；未成年雌性SD大鼠10只，21～25日龄，体质量50～70 g。北京维通利华实验动物中心提供。

1.2 实验药物 补肾调肝方乌萸汤组方：乌药、山茱萸、菟丝子、肉苁蓉、丹参、鸡血藤、香附、煅紫石英等。按课题需要计算得出总量，将药物从北京同仁堂股份有限公司一次性购入，核实饮片基原、产地、批号、性状，根据《中华人民共和国药典（2005年版）》要求鉴定为正品后，由北京中医药大学制剂室按常规方法一次性煎煮、浓缩，按照所需配成高、中、低浓度药液，2～8℃条件下保存备用。

1.3 主要试剂和仪器 注射用尿促卵泡激素（FSH 75IU/支）购自丽珠制药厂，孕马血清（PMSG1000IU/支）购自内蒙古赤峰博恩药业有限公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司，胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM-F12培养基、青-链霉素溶液均购自美国生命技术公司（GIBCO/BRL）；雌二醇（E2）放免检测药盒，购自北京北方生物技术研究所。聚合酶链式反应（PCR）引物，购自北京三博远志生物技术有限公司。Trizol购自Invitrogen公司，反转录酶（M-MLV Reverse Transcriptase） 购自 Promega公司，DNA Marker购自全式金生物技术有限公司，琼脂糖购自深圳晶美公司；INHB酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒，购于武汉中美生物试剂有限公司。

低温高速离心机：Sigma；半自动发光仪：日本滨松；光学显微镜：NIKON ECL IPSE E600；全自动酶标仪：Model550型Microplate Reader。倒置相差显微镜，日本Olympus IMT－2型。二氧化碳培养箱，美国NAPCOMODEL5410。超净工作台，北京昌平长城空气净化工程公司CJT-E-Ⅱ型。电热恒温水箱，上海实验仪器厂，HH-W21.420型。

2 实验方法

2.1 大鼠含乌萸汤中药血清与正常血清制备 取25只6周龄雌性SD大鼠随机分为5组，饲养和实验均在屏障环境动物实验室内进行。小鼠饲料、垫料、饮用水均经过消毒处理。正常对照组每日灌服0.5%的羧甲基纤维素钠（C MC）1.0mL/kg；大、中、小剂量组每日灌服乌萸汤浓缩液5、10、15mL/kg（分别相当于成人剂量的6倍、12倍、18倍），连续给药4 d；西药对照组大鼠每日皮下注射FSH 78 U/kg，连续4 d，各组样本均无死亡。于末次给药后1 h无菌状态下大鼠股动脉采血，分离血清，将每组血清混匀，分装，-80℃保存备用。

2.2 卵巢颗粒细胞的分离与原代培养 参照Lovekamp等[1]的方法，取10只上述未成年雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 100 IU，48 h后颈椎脱臼法处死。75%乙醇浸泡消毒，在无菌条件下迅速剖取卵巢放入冰冷的无菌PBS中，去除卵巢周围组织及表面包膜，PBS清洗后置于冰冷的DMEM-F12培养基中。在解剖显微镜下用小号针头刺破卵泡，使颗粒细胞释放入培养基，200目不锈钢细胞筛过滤。800 r/min离心5min，洗涤滤液，收集细胞。加入培养液（D MEM-F12培养基、15%胎牛血清、105U/L，青霉素和105U/L链霉素）制成单细胞悬液。台盼蓝染色，计数。将细胞稀释成浓度为3.0×108个/L的细胞悬液，接种于培养瓶中，在37℃、5%二氧化碳培养箱中预培养24 h后，细胞可贴壁生长，换液去除未贴壁细胞；此后隔日换液1次。

2.3 细胞培养及分组 颗粒细胞预培养24 h后分6组换液，每组于含15%胎牛血清的细胞培养液中分别加入10%的大、中、小剂量组中药血清、西药对照组血清、正常大鼠对照组血清，并设空白对照组（DMEM-F12培养基）。每组设6个复孔，继续培养48h。

2.4 用放免法测定乌萸汤方含药血清对颗粒细胞培养液中E2分泌的影响 用放射免疫法测定各组细胞上清液E2的含量。测定均按照试剂盒说明书进行。放射免疫法分析符合质控要求，批内变异系数<10%，批间变异系数<15%。

2.5 乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞FSHR mRNA表达量的定量测定 用实时荧光逆转聚合酶链反应（RT－PCR）方法实时、定量测定颗粒细胞FSHR mRNA的表达量。

2.6 乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞INHB的影响 本研究通过酶联免疫吸附试验（ELISA）技术，观察乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞INHB的表达的影响。

2.7 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件包，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用one－Way ANOVA进行分析。

3 结果

3.1 乌萸汤含药血清对各组卵巢GC分泌E2及FSHRmRNA、INHB的表达影响 见表1。

表1 乌萸汤含药血清对各组卵巢GC分泌E2及FSHRm RNA、INHB的表达影响(±s)Tab.1 effectsofW u Yu decoction drug-containing serum on serection of E2 ofGC and the expression of FSHRmRN,INBH of GC(±s)

表1 乌萸汤含药血清对各组卵巢GC分泌E2及FSHRm RNA、INHB的表达影响(±s)Tab.1 effectsofW u Yu decoction drug-containing serum on serection of E2 ofGC and the expression of FSHRmRN,INBH of GC(±s)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与西药对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与乌萸汤低剂量组比较☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与乌萸汤中剂量组比较★P＜0.05，★★P＜0.01。

组别 n E2空白对照组正常对照组西药对照组乌萸汤低乌萸汤中乌萸汤高6 6 6 6 6 6(pg/105)15.8317±2.8444 17.8867±3.3713 41.3500±11.029**▲▲35.6017±12.896**▲▲34.7600±9.0657**▲▲32.5050±4.1909**▲▲GCFSHRmRNA（起始拷贝数）1.1333±0.1797△△1.0267±0.1453△△5.6067±0.4273**▲▲5.3450±0.4093**▲▲7.9217±0.7511**▲▲△△☆☆5.0350±0.4984**▲▲△★★INHB(pg/105)15.8922±0.0353 15.8213±0.0381 16.8973±0.1029 16.7913±1.0916 19.2798±1.0518**▲▲△△☆☆17.7770±1.4172**▲▲

由表1可见，空白对照组与未用药大鼠血清组的E2分泌及FSHRmRNA、INHB的表达量差异无统计学意义，与空白及正常对照组相比，各加药组E2、FSHRmRNA、INHB的表达量均明显增高（P<0.01）；与西药血清组比较，乌萸汤低、中、高剂量血清组 E2水平偏低，但无显著性差异（P>0.05），乌萸汤中、高剂量血清组FSHRmRNA、INHB表达有显著性升高（P>0.05）。

3.2 Real-time PCR结果

3.2.1 标准曲线的生成 将预实验的PCR产物（mRNA表达比较高的）按照浓度梯度进行稀释，选择1/5，1/10，1/20，1/40浓度的稀释产物作为标准品模版，进行荧光定量PCR反应。通过这4个标准品生成的反应数据，软件Rotor-Gene 6.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线，见图1。

3.2.2 FSHR Real-Time PCR溶解曲线，溶解曲线图显示扩增的内参基因GAPDH和目的基因FSHR cDNA的溶解温度(Tm)分别为87.0℃，85.0℃，且均为单峰。无非特异性扩增，见图2。

4 讨论

FSH是调节女性卵巢功能的关键激素，但FSH需与位于卵巢颗粒细胞上的FSHR结合后方可激活颗粒细胞内的芳香化酶(P450arom)，使卵泡膜细胞产生的雄激素芳香化并形成卵泡自身内的雌激素微环境[2]。因此，雌激素的生成还受卵泡内FSHR含量的限制，卵巢对促性腺激素的反应与颗粒细胞FSHRmRNA的表达量高低有关[3]。抑制素INHB是一种选择性抑制FSH分泌的性腺肽，可以增强卵巢-垂体轴的反馈性调节[4]。INHB主要由卵巢颗粒细胞分泌，卵巢储备功能出现减退时，血清INHB先于FSH产生变化。血清INHB水平降低是女性卵泡减少、卵巢老化的最早标志[5]，在生殖内分泌领域具有重要意义。INHB对FSH负反馈调节的减弱，可导致FSH水平的增高。INHB还可以通过调节增加E2底物来调节E2的产生。因此，INHB和FSH、E2一样可以反映卵巢的功能状态。

本实验结果提示各用药组GC分泌E2均有提高，而FSH含药血清提高GC分泌E2效果优于中药各组；补肾调肝方乌萸汤可以增加卵巢颗粒细胞INHB和FSHRmRNA的表达，其中剂量组效果优于FSH含药血清组，由此可见，乌萸汤可通过提高卵巢对促性腺激素的反应性及调控卵巢局部因子途径为靶点，调节下丘脑-垂体-卵巢系统，同时可直接对卵巢起调节作用。从而说明补肾调肝治疗对女性性腺轴功能具有双相调节作用，能够使下丘脑-垂体-性腺轴的功能得以改善，达到促进卵泡发育成熟以调经促孕的目的。中药的多靶点、多环节调节作用，而不仅仅是代替激素的作用，可能正是中医药调节生殖内分泌的特点和意义所在。

[1]Lovekamp TN,Davis BJ.Mono-(2-ethylhexy)phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulosa cells[J].ToxicolApplPharmacol,2001,172(3):217-224.

[2]De Castro F,Ruiz R,Montoro L,et al.Role of follicle-stimulating hormone receptor Ser680Asn polymorphism in the efficacy of follicle-stimulatinghormone[J].Fertil Steril,2003,80(3):571-576.

[3]楼航英,黄荷凤,金 帆.超排卵时卵巢对促性腺激素的反应与颗粒细胞促卵泡激素受体的表达[J].浙江大学学报 (医学版),2002，31(3)∶151-154.

[4]AriciA,Matalliotakis IM,KoumantakisGE etal1 Diagnostic role of inhibin B in resistant ovary syndrome associated with secondary amenorrhea1 FertilSteril,2002,78(6):324-326.

[5]SHYR-Yeu Lin,John RMorrison,David J,etal.Regulation ofovarian function by the TGF-superfamily and follistatin[J].Reproduction,2003,126:133-148.

Effects of Wu Yu decoction drug-containing serum on expression of INHB,FSHRm RNA in ovarian granulose celland secretion function

LILING1,HUANGWen-ling2,JIN Zhe2,atal
(1.ClinicalCollegeofBeijing University ofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.DepartmentofGynecology,Dong Fang Hospital,Beijing University ofChineseMedicine,Beijing 100078,China)

[Objective]To research theeffectsofWu Yu decoction drug-containing serum on the expression of INHB,FSHRmRNA in ovarian granulose cell(abbr.GC)and the secretion function in rats.[Methods]Wu Yu decoction,FSH drug-containing serum and the normal ratserum were added into ratovarian GC culturemedium system.Theywere cultured for48 hours.The expression of INHBwasmeasured by ELISA,FSHRmRNA expression levels by RT-PCR,E2 levelsofeach group by radioimmunoassay.[Results]The E2 levelwas significantly higher in treatmentgroups than that in controlgroups,and the expression of INHB,FSHRmRNA significantly increased,among themmedium dosagegroup ofWu Yu decoctionwas superior than that inWesternmedicine groups.[Conclusion]Wu Yu decoction drug-containing serum promotes the expression of INHB,FSHRmRNA and secretion of E2 ofovarian GC significantly.It is proved thatWu Yu decoction can enhance the ovarian reaction function to gonadotropins and improve the HPOA through adjusting internal factors ofovary and enhancing the expression of FSHRmRNA,thereby to promote the developmentandmaturation of follicular and ovulation.

Wu Yu decoction；ovarian granulose cell；INHB； FSHRmRNA；E2

R285.5

A

1672-1519(2010)02-0144-03

教育部新教师基金（20070026036）。

李 玲（1977-），女，博士研究生，主治医师，主要从事中医妇科内分泌、辅助生殖方面研究。

2009-12-26）