1,6-二磷酸果糖预处理对家兔急性肾缺血再灌注损伤的保护作用＊

刘行海 买文丽 刘红 郑倩 敬华娥 易志刚

(1.川北医学院基础医学院生理学教研室;2.川北医学院附属医院儿科,四川 南充 637000)

肾缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤导致的急性肾功能衰竭在临床上具有很高的发病率和死亡率。因此,如何减轻或避免肾缺血-再灌注损伤一直是临床和基础实验研究的重点。1,6-二磷酸果糖(FDP)作为糖酵解中高能中间代谢产物,近年研究发现其对心脏、脑、小肠等器官的缺血再灌注损伤有较好的防治效果[1-3],但关于FDP在肾I/R损伤方面的研究较少。本实验通过建立兔肾缺血60min再灌注180min致肾I/R损伤模型,探讨FDP对兔急性I/R损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 药物和试剂 FDP由山东新华制药股份有限公司提供,产品批号：0906030。血尿肌酐、尿素氮、SOD和 MDA测定试剂盒由南京建成生物工程有限公司提供产品批号：20091020。

1.2 动物分组及术前处理 健康雄性新西兰大白兔27只,本院实验动物中心提供,6月龄,体质量2.5±0.28kg,雌雄不拘,随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I组)和1,6-二磷酸果糖预处理组(F组),每组9只,置空调室常规喂养。术前4d每天1次,F组于耳缘静脉缓慢输注1,6-二磷酸果糖(用生理盐水稀释成每ml含FDP为50mg,100mg◦kg-1)。S组和I组均仅用2ml◦kg-1生理盐水。

1.3 肾脏缺血再灌注模型的复制 1%戊巴比妥钠溶液(3ml◦kg-1,iv),麻醉兔。腹中线切口,去左肾。分离右肾动、静脉并夹闭,60min后恢复灌流,观察肾脏颜色变化,确定血流5min之内恢复,关闭腹腔再灌注180min时取右肾。假手术组开腹后仅行左肾切除,右肾蒂游离。

1.4 标本采集及观察指标 于实验结束时心脏取血,测定血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)含量。右肾标本用4℃冷生理盐水冲洗去血液,剪下肾下极组织滤纸吸干,随即称取0.5g加4℃生理盐水4.5ml,用玻璃匀浆器制成10%的组织匀浆,采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,以 TBA比色法测定MDA含量。同时摘取部分右肾组织置于10%中性甲醛溶液中固定24h后常规石蜡包埋,按病理学常规制片HE染色,光学显微镜观察肾组织病理变化和肾小管评分。根据Jablonski等[4]制定的肾脏近曲小管坏死程度分级标准分为5级：0级为正常;1级为单个细胞的坏死伴核分裂;2级为相邻近曲小管所有细胞的坏死,但周围小管存活;3级为限定于近曲小管远端1/3细胞的坏死并扩展到皮质和髓质交界处;4级近曲小管整段坏死。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行处理,计量资料以表示,采用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏功能的测定 与S组比较,I组和F组血清Cr、BUN水平均升高(P＜0.05),而 F组低于 I组(P＜0.01),见表1。

表1 血清中Scr、BUN含量的变化(±s,n=9)

表1 血清中Scr、BUN含量的变化(±s,n=9)

＊P＜0.05 vs S group;#P＜0.01 vs I group.

group Scr(μ mol◦ L-1) BUN(mmol◦L-1)S 59.09±15.08 6.48±1.27163.36±19.21＊ 16.24±3.23＊F 112.06±8.15＊# 9.76±0.73＊#I

2.2 肾组织MDA含量、SOD活性的变化 与S组比较,I组和F组再灌注后肾组织SOD活性均降低、MDA含量均升高(P＜0.01);而 F组SOD、MDA分别高于和低于 I组(P＜0.05),见表2。

2.3 肾组织病理学改变 光镜下观察：S组兔肾组织结构基本正常;I组大部分肾小管上皮细胞出现程度较重的肿胀及不同程度坏死,肾间质局部出血水肿及明显炎性细胞浸润;F组仅见部分肾小管上皮细胞轻度肿胀,少量变性与坏死,肾间质局部轻度出血水肿及炎性细胞浸润。F组肾小管计分明显低于I组(P＜0.05),见表3。

表2 肾组织中SOD活性、MDA含量的变化(±s,n=9)

表2 肾组织中SOD活性、MDA含量的变化(±s,n=9)

＊P＜0.01 vs S group;#P＜0.05 vs I group.

group SOD(U◦mg-1) MDA(nmol◦mg-1)S 240.02±10.91 3.14±0.63145.90±10.26＊ 5.88±2.38＊F 177.93±22.77＊# 3.91±1.17＊#I

表3 肾小管计分的变化±s,n=5)

表3 肾小管计分的变化±s,n=5)

＊P＜0.05 vs S group;#P＜0.05 vs I group.

group n scores of tubules S 50.24±0.323.12±0.53＊F 51.45±0.44＊#I 5

3 讨论

缺血-再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节,也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素。现已公认肾脏I/R损伤与活性氧自由基的产生密切相关[5]。FDP作为糖酵解的中间产物,近年来发现其对心脏、脑、小肠、肝等组织器官缺血再灌注损伤有较好的保护作用。研究表明FDP可保护心肌的SOD活性,增强心肌清除超氧阴离子的能力,从而减少心肌细胞生成过氧亚硝酸阴离子[6]。Markov等的实验结果提示FDP通过激活人、犬的嗜中性白细胞,抑制超氧阴离子O-2和H2O2的产生,提示FDP本身具有与超氧化歧化酶(SOD)相似的抗氧化作用[7]。

在肾脏I/R损伤过程中,肾脏在黄嘌呤氧化酶的催化下,由次黄嘌呤生成尿酸的过程中及中性粒细胞等作用下产生大量的活性氧自由基。氧自由基具有很强的生物活性,通过与细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应。MDA为脂质过氧化代谢产物,其水平增高时,可引起明显的细胞或组织损伤;SOD是自由基的重要清除酶之一,可减轻脂质过氧化,对组织或细胞具有保护作用。因此如若组织中的SOD活性增加,M DA含量减少就可以反映对缺血再灌注脏器的保护作用。本研究中根据人和动物之间的剂量换算关系,采用FDP剂量为100mg◦kg-1,结果发现在缺血再灌注180min,经 FDP预处理后肾组织SOD与模型I组相比,SOD活性升高,M DA含量明显降低,同时 F组BUN、Cr升高轻于I组(P＜0.01)。光镜下可见肾小管上皮细胞肿胀,变性和坏死程度均较I组明显减轻,肾小管评分也明显低于I组(P＜0.05)。表明FDP可通过提高SOD活性,减轻缺血-再灌注中氧自由基介导的组织脂质过氧化反应,这可能是减轻肾缺血再灌注损伤的机制之一。

综上所述,FDP对肾缺血再灌注后的肾脏具有保护作用,部分是通过提高超氧化物歧化酶活性,减少氧自由基生成来发挥作用,至于FDP的保护机制和使用的最佳时机及浓度等有待进一步研究。

1 刘福林,周玉娟,白杰,等.1,6-二磷酸果糖预处理对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学会通讯,2000,1：57-58.

2 史晓峰,刘敦贵.1.6-二磷酸果糖在大鼠小肠缺血再灌注损伤中的保护作用[J].中国临床营养杂志,2003,11(4)：278-280.

3 曾凡新,董志.周螋新,等.果糖二磷酸钠镁对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用[J].中国药房,2003,14(10)：593-595.

4 Jablonski P,Howden BO,Rae DA,et al.An experimental model for assessment of renal recovery f rom warm ischemia[J].Transplantation,1983,35(3)：198-204.

5 Wmk da,Mitchell JB.Chemical biology of nitric oxide：insights into regulatory,cytotoxic,and and cytoprotective mechanisms of nitric oxide[J].Free Radical Biology and Medicine,1998,25(4-5)：434-456.

6 阳冠明,李树全,叶司原,等.1,6-二磷酸果糖对阿霉素导致大鼠酪氨酸硝基化的影响[J].中国药理学报,2002,18(2)：161-165.

7 Markov AK,Rayburn TS.Fructose-1,6-diphosphate alone and in combination with cyclosporine potentiatesrat cardiac allograft survival and inhibits ly mphocyte proliferationand interleukin-2 ex pression[J].T ransplantation,2002,74(11)：1651-1654.