血红蛋白抗大鼠大肠埃希菌阴道感染研究＊

周新娥 欧阳运薇 潘小玲△ 何跃东 李恒 邓璐霞 黄宁 吴琦

(1.成都市妇产科医院妇产科,成都 610015;2.四川大学华西第二医院妇产科,成都 610041;3.四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫教研室,成都 610041)

女性生殖道感染是妇产科的常见病、多发病,各年龄组均可发病。大肠埃希菌既是女性阴道正常菌群之一,又是引起女性生殖道感染常见革兰阴性菌之一,比如,在近25%的细菌性阴道病患者中可以分离到大肠埃希菌。

血红蛋白除了最基本的携氧功能外,新近发现血红蛋白及其片段还具有抗菌的生物学活性[1-3]。迄今,血红蛋白及其片段的抗菌活性研究均见于体外实验,而无整体动物实验报道。因此我们建立大鼠大肠埃希菌阴道感染模型,通过阴道局部给予血红蛋白,探讨血红蛋白在体内是否具有抗菌抑炎作用,从而为将来直接应用或者间接通过基因工程生产血红蛋白片段重组产品用于临床包括女性生殖道感染在内的防治提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 一氧化碳购自四川天一科技股份有限公司。

1.1.2 实验动物 雌性Wistar大鼠,性成熟未交配,体重180.2±5.8g,由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。

1.1.3 病原体 大肠埃希菌临床分离株来自四川抗生素研究所馈赠。

1.2 实验方法

1.2.1 裂解红细胞、分离提纯出血红蛋白 取志愿者数毫升血液肝素抗凝,通入一氧化碳气体180s并轻摇,生理盐水洗三次,离心除上清,加入0.2倍体积二氯甲烷漩涡振荡3min后离心取最上层,再重复加入二氯甲烷处理。避光60℃加热1h,离心取上清,即为血红蛋白。

1.2.2 建立大鼠阴道感染模型 无菌条件下切除大鼠双侧卵巢,皮下注射苯甲酸雌二醇建立和维持假动情期,皮下注射氢化可的松琥珀酸钠造成全身免疫力低下,生理盐水反复冲洗阴道后,阴道内注入大肠埃希菌(2.1×109CFU◦ml-1),每日接种一次,共接种三次。每日观察大鼠外观和阴道外口分泌物、局部有无红肿等炎性表现。造模动物隔日交替皮下注射苯甲酸雌二醇或氢化可的松琥珀酸钠,以维持动情期和免疫功能低下状态。感染5d后肉眼和病理组织学检查阴道粘膜充血、水肿或炎细胞浸润等者为感染成功。

1.2.3 实验动物的分组及处理 将感染成功的大鼠随机分组：基质对照组(感染后不治疗,n=7),血红蛋白治疗组(实验组,n=9),每只每天阴道给血红蛋白5mg,连续5d。另设模型对照组(n=5),正常对照组(n=2)。

1.2.4 病理观察 末次给药后24h将大鼠处死取子宫宫颈阴道标本,先进行肉眼观察、称重。计算脏器指数：子宫宫颈阴道重量(g)/体重(g)然后进行常规石蜡切片,HE染色,镜下观察阴道组织形态学变化及粘膜、粘膜下间质形态学的炎症改变程度,根据评定标准评定炎症程度。

图1 大鼠阴道分泌物涂片(200×)

1.3 统计学处理 采用统计软件spss13.0,单因素方差分析。

2 结果

2.1 实验大鼠动情周期的监测

大鼠去卵巢后的阴道分泌物涂片镜下观如图1A,镜下见大部分是白细胞,偶尔可见有核扁平上皮细胞。给予苯甲酸雌二醇后的阴道分泌物涂片镜下观如图1B,镜下见膨大的上皮细胞核消失,脱落的角化上皮细胞并聚,似落叶堆叠。如去卵巢后大鼠的阴道涂片不似图1A,说明该只大鼠的卵巢未切除完全,剔除该只大鼠;如给予苯甲酸雌二醇皮下注射后的阴道分泌物不似图1B,进一步说明该只大鼠的卵巢未切除干净存在内源性雌激素,也剔除该只大鼠。

2.2 大鼠的子宫宫颈阴道脏器指数的影响

血红蛋白组、模型对照组间无差异(P＞0.05),基质对照组与前两组比有显著性差异(P＜0.05),血红蛋白组的脏器指数较基质对照组的减少明显,提示血红蛋白能减轻感染后的局部水肿等炎症程度,见表1。

2.3 大鼠阴道组织形态学观察

从图2可见,模型对照组大鼠复层扁平上皮较正常大鼠稍厚,表层平滑完整,固有层全层较疏松,余未见异常;基质对照组大鼠复层扁平上皮表层不平滑,固有层内有大量的炎细胞浸润伴血管扩张充血;与基质对照组相比,血红蛋白组大鼠阴道复层扁平上皮表层较平滑,固有层内炎细胞浸润明显减少,且组织内充血明显减轻。复层扁平上皮的增厚可能与外源性雌激素的作用有关,因为雌激素可导致阴道复层扁平上皮增生和角化,粘膜增厚。

表1 血红蛋白对大鼠子宫宫颈阴道脏器指数的影响()

表1 血红蛋白对大鼠子宫宫颈阴道脏器指数的影响()

组 别 动物数(只)子宫宫颈阴道脏器指数(g◦g-1)模型对照组 5 3.52×10-3±3.63×10-4基质对照组 7 5.38×10-3±7.44×10-4血红蛋白组 9 3.88×10-3±4.56×10-4

3 讨论

女性生殖道感染是妇科常见疾病,各年龄组均可发病,育龄妇女是生殖道感染的主要易患人群,可造成流产、早产、低出生体重儿、异位妊娠、盆腔炎症、宫颈癌、焦虑等,严重影响育龄妇女的生殖健康和身心健康。因而,生殖道感染是目前国内比较关注的生殖健康问题。

图2 各组大鼠阴道病理变化(HE)

目前有关细菌性阴道感染动物模型的报道,采用的方式一为去除卵巢后给外源性雌激素,反复阴道冲洗后再以细菌攻击。另一方式直接用细菌攻击。前者的优点在于先去除卵巢消除了内源性雌激素对大鼠动情周期的影响,再给予外源性雌激素使动物同步维持在动情周期的动情期阶段,有文献报道动情期动物更易于细菌的阴道定植[4];加用糖皮质激素,使造模动物全身免疫功能低下;而阴道冲洗可改变阴道pH值,阴道环境改变,更有利于大肠埃希菌等病原体在阴道粘膜的定植[5]。直接用细菌攻击建造模型的方法,虽然步骤简单,实验周期短,但是由于动物可能处于动情周期的不同阶段,或由于其保持原有免疫功能从而可能影响感染动物之间的同步性。所以本实验选择了第一种方式来建立动物模型,通过阴道分泌物涂片白细胞及脱落上皮细胞的变化来监测模型动物去卵巢和外源性雌激素的效果。在给予大肠埃希菌攻击后,大鼠阴道外口变化及阴道病理切片均证实了模型建立成功。

迄今治疗阴道炎的主要手段是采用抗菌类的化学合成药物,其治疗方式多为阴道冲洗、口服或阴道局部给药。然而采用这些治疗可能带来菌群失调的后果,表现为正常乳酸杆菌明显减少,而肠杆菌、球菌却异常增多。而且化学合成药物虽短期疗效好,但由于其有致畸可能等原因多慎用于孕妇、特别是停药后易复发,同时也极易诱发细菌产生耐药性成为其弱点。所以开发应用新型天然药物以治疗阴道炎是基础与临床应用重要的研究方向之一。比如新近应用乳酸杆菌等生物活性剂,通过调节阴道内正常菌群,起到抑制致病菌生长的作用。

血红蛋白在体外具有强的抗大肠埃希菌作用,是一种内源性的抗菌肽分子,由于内源性抗菌肽分子具有较低几率产生耐药性的特点,所以学术界认为它有可能是新抗微生物战略中的重要后选分子之一。各组阴道组织病理切片HE染色镜下观,证实血红蛋白处理后阴道炎细胞侵润数较基质对照组减少,血管扩张减轻消失。同时血红蛋白组大鼠的子宫宫颈脏器指数较基质对照组降低,也提示血红蛋白能减轻大鼠大肠埃希菌性阴道感染的炎症反应程度。

文献报道血红蛋白及其片段有直接的抗大肠埃希菌作用,虽本实验在动物体内直接使用的是血红蛋白,但血红蛋白在生物学活体内可受酶解成血红蛋白片段。Inavon[6]认为血红蛋白在红细胞内自然分解生成一些较大的片段,然后分泌出红细胞,在细胞外不同组织进一步分解成为较小的血红蛋白片段,形成所谓的“血红蛋白肽库”,以发挥它们的不同生物学效应。Mak[2]认为血红蛋白在阴道受氨基肽酶或羧基肽酶的影响可降解为血红蛋白片段发挥抗菌作用。因此本实验虽直接使用的是血红蛋白,在动物感染炎症模型中,它也可能在白细胞等释放的蛋白酶作用下,降解为不同分子的片段起到抗菌抑炎的作用。

1 Liepke C,Baxmann S,Heine C,et al.Human hemoglobin-derived peptides exhibit antimicrobial activity：a class of host defense peptides[J].Journal of Chromatography B,2003,791(1-2)：345-356.

2 Mak P,Wicherek L,Suder P,et al.Analy sis of free hemoglobin level and hemog lobin peptides from human puerperal uterine secretions[J].J Soc Gynecologic Investig,2006,13(4)：285-291.

3 王莉莉,潘小玲,马懿,等.子宫内膜黏液抗菌肽的分离纯化及鉴定[J].中华医学杂志,2006,86(29)：2044-2048.

4 刘文.大鼠阴道炎模型的建立及妇炎消洗剂治疗作用的研究[J].贵阳中医学院学报,1996,18(4)：59-60.

5 石一复.盆腔炎的诱发因素[J].中国实用妇科与产科杂志,1998,14(6)：323-324.

6 Ivanov V T,Karelin AA,Philippova MM.Hemoglobin as a sourse of endogenous bioactive peptides：the concept of tissue-specific peptide pool[J].Biopolymers,1997,43(2)：171-178.