角质形成细胞对胞内金黄色葡萄球菌抗菌作用研究＊

刘明岩 耿会珍 蒋献 黄宁 王伯瑶 吴琦△

(1.四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室,四川 成都 610041;2.四川大学华西医院皮肤科,四川 成都 610041)

天然免疫系统是机体抵御病原体入侵的第一道防线,它能够在获得性免疫系统产生针对性更强的特异应答之前,率先消除或减轻由病原体入侵所造成的后果。天然免疫通过物理、化学与生物学屏障,阻挡或消灭入侵的病原体,同时减轻组织损伤与细胞坏死,遏制病原体可能引起的病理生理学改变。上皮细胞是天然免疫的重要组成部分,最近的研究显示,通过上皮细胞与细菌的直接接触,或者上皮细胞吞噬摄取细菌,上皮细胞有很强的抗菌能力。

角质形成细胞在皮肤免疫防御和炎症反应中功能活跃,是皮肤复杂生化防御机制的细胞基础,由角质形成细胞产生的抗菌效应分子形成了皮肤的抗菌屏障(Antimicrobial barrier)。金黄色葡萄球菌在医学上占据重要地位,既可以引起局部感染,也可以造成全身系统性感染。在皮肤感染中金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌,但正常皮肤有时也可以检出金黄色葡萄球菌,因此研究角质形成细胞与金黄色葡萄球菌的关系对认识皮肤抗感染防御机制及皮肤感染性疾病发病机理都有帮助。本文观察了金黄色葡萄球菌在角质形成细胞中的存活情况。

1 材料与方法

1.1 材料

金黄色葡萄球菌(ATCC)标准株25923本室保存,人角质形成细胞株HaCaT为本室保存。RPMI-1640为GIBCO产品,新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司,TritonX-100,佛波酯(PMA)、Forskolin(FSK)购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

从LB平板中挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基,150转◦min-1振荡培养3～5h,取100ul菌液铺于LB固体培养板,37℃孵箱培养16h后收集活菌,用PBS洗涤细菌三次,紫外分光光度计测定600nmOD值确定细菌浓度。

1.2.2 角质形成细胞株HaCaT培养

HaCaT细胞用含10%新生牛血清的1640培养基(无抗生素),37℃5%CO2孵箱常规培养传代。实验时以1.2×105个细胞◦孔-1接种于24孔板,待细胞融合时(≈2.5×105◦孔-1)进行实验。

1.2.3 金黄色葡萄球菌在细胞HaCaT内存活的动态观察

HaCaT细胞用PBS洗三次,加入用1640培养基稀释好的细菌,每孔400μ l,细菌与细胞的比例为100∶1,置CO2孵箱孵育2h。用含有庆大霉素(100μ g◦ml-1)的PBS洗细胞三次,每孔加入含有庆大霉素(100μ g◦ml-1)及10%新生牛血清的1640培养基1000ul,37℃5%CO2孵箱孵育,以杀死胞外金黄色葡萄球菌。分别于实验4、24、48及72h,用0.25%TritonX-100裂解细胞,释放出细胞内的活细菌,用平板菌落计数法计数胞内活菌数。每实验组为3复孔,每孔样品涂2个细菌培养板。

1.2.4 PM A、FSK对 HaCaT细胞抗菌作用的影响

HaCaT细胞用PBS洗三次,加入用1640培养基稀释好的细菌,每孔400μ l,细菌与细胞的比例为100∶1,置CO2孵箱孵育2h。用含有庆大霉素(100μ g◦ml-1)的PBS洗细胞三次,每孔加入含有庆大霉素(100μ g◦ml-1)、10%新生牛血清及 PM A(或FSK)的1640培养基1000ul,培养基中 PMA终浓度分别为0(对照)、1 μ M 、2 μ M 、5 μ M;培养基中 FSK 终浓度分别为 0(对照)、1μ M 、2 μ M 、5 μ M 。 置 37℃ 5%CO2孵箱孵 育。 在实 验开始(加入细菌)后的24h,用 0.25%T ritonX-100裂解细胞,释放出细胞内的活细菌,平板菌落计数法计数胞内活菌数。每个实验组为3复孔。

1.3 统计学处理 实验数据以SPSS进行统计学处理,数值以表示。采用 t检验。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌在HaCaT细胞内的动态变化

结果显示,24h细菌数量比4h增加16.0%,48h细菌数量比4h减少74.5%,而72h胞内细菌数量比4h减少了95.9%(图1)。

图1 金黄色葡萄球菌ATCC 25923株在HaCaT细胞内存活的动态观察

2.2 PMA对HaCaT细胞抗菌作用的影响

实验发现,1μM组细胞内活菌数量与空白对照组相比减少14.52%。2μM组细胞内活菌数量与空白对照组相比减少26.16%。5μM组细胞内活菌数量与空白对照组相比减少46.05%(P＜0.05)。结果说明使用PMA可以促进皮肤角质形成细胞杀灭胞内金黄色葡萄球菌,并且PMA作用呈浓度依赖关系(图2)。

图2 PMA对金黄色葡萄球菌ATCC 25923株在HaCaT细胞内存活的影响

2.3 FSK对HaCaT细胞抗菌作用的影响

实验结果发现,1 μ M组细胞内活菌数量与空白对照组相比减少35.32%。2 μ M组细胞内活菌数量与空白对照组相比减少41.28%。5 μ M组细胞内活菌数量与空白对照组相比减少69.98%(P＜0.05)。实验说明使用FSK可以促进皮肤角质形成细胞清除胞内菌,并呈浓度依赖关系(图3)。

3 讨论

人体的皮肤与粘膜有大量微生物寄居,正常情况下这些微生物与我们机体处于共生状态,而不发生感染致病,这主要应该归功于和微生物直接接触的上皮细胞的保护作用。上皮细胞与细菌之间的信息交流,上皮细胞怎样有效控制细菌,不使它们过度生长或者造成感染,成为医学研究的重要内容[1]。

过去曾经认为只有少数细菌(比如结核杆菌)能够进入细胞,而大多数细菌则被认为引起细胞外感染。最近10多年医学微生物学研究结果改变了这一观点,许多细菌在感染致病过程中不但粘附于上皮细胞,它们还能够进入细胞,这个现象被称为侵袭(Invasion)。肠道致病菌如沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌,呼吸道致病菌如铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯杆菌,都能够进入上皮细胞。细菌侵袭上皮细胞是宿主和微生物之间在长期生命进化过程中共同形成的一种生物学现象,这一现象是否促进细菌感染致病只能取决于双方的情况,也即侵入的细菌是否足以对抗上皮细胞内复杂而强大的天然免疫机制。

图3 FSK对金黄色葡萄球菌ATCC 25923株在HaCaT细胞内存活的影响

金黄色葡萄球菌不但在正常皮肤可以检出,更是皮肤感染的重要致病菌,因此很有必要探讨角质形成细胞与金黄色葡萄球菌的关系。有关金黄色葡萄球菌侵袭的研究更多是站在细菌致病性的角度在探讨这一现象,而较少涉及上皮细胞对外来微生物的免疫防御作用[2-4]。本研究在体外细胞模型观察了金黄色葡萄球菌对HaCaT细胞的侵袭,HaCaT细胞是自发转化的永生化皮肤角质形成细胞而非肿瘤细胞,它在生物特性上与正常人角质形成细胞很接近。实验观察到金黄色葡萄球菌进入细胞24h比4h有增加,表明这段时间细菌有生长,而48h细菌显著下降,提示细胞产生了较强抗菌作用。为探讨HaCaT细胞清除胞内细菌的机制,实验用蛋白激酶C激活剂(PMA)及腺苷酸环化酶激活剂(FSK)作用于细胞,结果观察到这二种试剂都显著增强了细胞的抗菌活性。PMA激活蛋白激酶C,后者可以激活NADPH氧化酶(NOX家族),另外有文献报道FSK可以激活NOX家族的Duox-1[5],因此本实验结果提示HaCaT细胞清除胞内细菌可能与NOX分子产生的活性氧相关。最近已有报道显示呼吸道上皮细胞产生活性氧可能是其防御机制[6-7],本研究提供了NADPH氧化酶与皮肤抗感染相关的线索,值得作深入研究。

1 Aldridge PD,Gray MA,Hirst BH,et al.Who's talking to whom Epithelial-bacterial pathogen interactions[J].Molecular Microbiology,2005,55(3)：655-663.

2 Fowler T,Johansson S,Wary KK,et al.Src kinase has a central role in in vitro cellular internalization of Staphylococcus aureus[J].Cell Microbiol,2003,5(6)：417-426.

3 Nuzzo I,Sanges MR,Folgore A,et al.Apoptosis of human keratinocytes after bacterial invasion[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2000,27(3)：235-240.

4 Mempel M,Schnopp C,Hojka M,et al.Invasion of human keratinocytes by Staphy lococcus aureus and intracellular bacterial persistence represent haemoly sin-independent virulence mechanisms that are followed by features of necrotic and apoptotic keratinocyte cell death[J].Br J Dermatol,2002,146(6)：943-951.

5 Rigutto S,Hoste C,Grasberger H,et al.Activation of dual oxidases Duox1 and Duox2：differential regulation mediated by camp-dependent protein kinase and protein kinase C-dependent phosphorylation[J].J Biol Chem,2009,284(11)：6725-6734.

6 Lipinski S,Till A,Sina C,et al.DUOX2-derived reactive oxygen species are effectors of NOD2-mediated antibacterial responses[J].J Cell Sci,2009,122(Pt 19)：3522-3530.

7 Moskwa P,Lorentzen D,Ex coffon KJ,et al.A novel host defense sy stem of airways is defective in cystic fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175(2)：174-183.