RP-HPLC法同时测定红景天苷原料药中红景天苷及其有关物质的含量

张罗红 彭艳 徐燕

(1.四川省食品药品检验所,四川 成都 610097;2.南京医科大学药学院,江苏 南京 210029)

红景天苷(Salidroside),化学名为“对羟苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-β-D-glucopyranoside)” ,白色晶体性粉末,是红景天的主要药理活性成分。红景天苷具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老及增强脑力、体力机能等方面的特殊功效[1-2]。药理实验表明,红景天提取物红景天苷有良好的心血管系统作用[3-5],在脑缺血、缺氧,神经元细胞凋亡方面均有一定的保护作用[6-8]。临床上红景天苷主要用于治疗心脑血管疾病。目前有关红景天中红景天苷含量测定的报道较多[9-15],但未见对原料药中红景天苷及3个有关物质(其分离与结构鉴定同时测定的报道。本研究采用RP-HPLC法同时测定红景天苷原料药中红景天苷及其有关物质的含量,结果该方法简便、灵敏。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

LC-10A型高效液相色谱仪系列(日本岛津)。红景天苷对照品(含量测定用,批号：110818-200404,中国药品生物制品检定所);淫羊藿次苷 D2、4-乙酰基苯酚-β-D-葡萄糖苷、云杉素对照品(自制,从红景天苷原料药中分离纯化得到,纯度均大于99%);红景天苷原料药(批号：060601、060603、060605、060607、060609,成都恒基医药科技有限公司);甲醇为色谱纯;水为纯化水。

1.2 含量测定方法

1.2.1 含量测定色谱条件 色谱柱：Shim-pack C18柱(5 μ m,4.6×150mm,Shimadzu);流动相：甲醇/水(15/85,v/v);检测波长为275nm;进样量为 20μ L;流速为1.0mL◦min-1;柱温为25℃0。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 对照品储备液配制分别精密称取红景天苷、淫羊藿次苷D2(Imp 1)、4-乙酰基苯酚-β-D-葡萄糖苷(Imp 2)和云杉素(Imp 3)对照品适量,加流动相制成 1.0、0.2、0.1、0.1mg◦mL-1的对照品储备液。

1.2.2.2 对照品溶液配制 精密量取各对照品储备液适量,加流动相稀释分别制成 30.0、125.0、250.0、500.0、750.0、1000.0μ g◦mL-1的红景天苷对照品溶液;1.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0μ g◦mL-1的 Imp 1 对照品溶液;0.3、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μ g◦ml-1的 Imp 2 对照品溶液;0.1、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μ g◦mL-1的Imp 3对照品溶液。

1.2.2.3 供试品溶液配制取红景天苷原料药适量,精密称定,加流动相制成1mg◦mL-1的供试品溶液。

1.2.3 系统适用性试验 色谱柱的理论塔板数(N) 取红景天苷对照品适量,注入液相色谱仪,按“1.2.1”色谱条件测定。

分离度(R)取供试品溶液适量,注入液相色谱仪,按“1.2.1”色谱条件测定。

1.2.4 检测限与定量限试验 在“1.2.1”色谱条件下,按信噪比(S/N)为3对检测限进行测定,按信噪比为10对定量限进行检测。

1.2.5 线性关系测定 将上述系列对照品溶液按“1.2.1”项下的色谱条件进样,分别测定其峰面积,以浓度(mg◦mL-1)对峰面积进行线性回归。

1.2.6 日内与日间精密度试验 分别取红景天苷对照品溶液(250μ g◦mL-1)、Imp 1 对照品溶液(30μ g◦ml-1)、Imp 2 对照品溶液(4μ g◦mL-1)和Imp 3对照品溶液(3μ g◦mL-1),在“1.2.1”色谱条件下连续进样10次,以峰面积(Area)与保留时间(tR)考察其日内精密度,连续测定3d,考察日间精密度。

1.2.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液,每隔2h进样、测定一次,计算红景天苷、Imp 1、Imp 2和 Imp 3峰面积的相对标准偏差(RSD%)。

1.2.8 重现性实验 取同一批号样品6份,按“1.2.1”项下方法进行测定,分别用峰面积计算红景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3含量。

1.2.9 加样回收率试验 取已知含量的红景天苷原料药[红景天苷(970mg◦g-1),Imp 1(15mg◦g-1),Imp 2(4mg◦g-1),Imp 3(11mg◦ g-1)]9份,每份约100mg,精密称定,分别加红景天苷、Imp 1、Imp 2及Imp 3的对照品(按红景天苷原料药实际各成分含量的80%、100%、120%),按供试品溶液的制备方法进行制备,测定峰面积,计算回收率以及相对标准偏差。

1.2.10 样品的测定按“供试品溶液制备”方法制备5批(每批各3份)红景天苷原料药供试溶液品,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液,按上述色谱条件测定,以外标法计算含量。

2 结果

2.1 系统适用性试验结果

色谱柱的理论塔板数(N) 试验结果红景天苷对照品tR=(11.85+11.84+11.85)/3=11.85,N=(5268+5231+5203)/3=5234(n=3)。

图1 淫羊藿次苷D2(A)、4-乙酰基苯酚-β-D-葡萄糖苷(B)、云杉素(C)、红景天苷(D)对照品溶液和红景天苷原料药(E)的HPLC图

红景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3之间的分离度均大于1.5(图1)。

2.2 检测限与定量限试验

结果表明：红景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3的检测限依次为 100、50、10、10ng ◦ml-1,定量限依次为 10000、300、100、80ng◦mL-1。

2.3 线性关系测定结果

以峰面积为纵坐标,药物浓度为横坐标绘制标准曲线,并对所得数据进行回归分析,得回归方程与浓度的线性关系结果见表1。结果表明：红景天苷、Imp 1、Imp 2、Imp 3与峰面积的线性关系良好。

表1 红景天苷及有关物质的线性范围测定结果(n=6)

表2 红景天苷及有关物质的日内与日间精密度测定结果

2.4 日内与日间精密度试验

以峰面积(Area)与保留时间(tR)考察其日内精密度,连续测定3d,考察日间精密度。其结果如表2所示,RSD均小于2%,精密度良好。

2.5 稳定性试验结果

取同一批供试品溶液,每隔2h进样、测定一次,计算得到红景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3峰面积的 RSD分别为0.86%、1.12%、1.26%、1.14%。试验表明供试品溶液至少在10h内稳定。

2.6 重现性实验

取同一批号样品6份,进行测定,分别用峰面积计算红景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3含量,其平均含量分别为 970mg◦g-1、15mg◦g-1、4mg◦g-1、11mg◦g-1,RSD 分别为 0.47%、0.88%、1.01%、0.85%。试验表明本法重现性较好。

2.7 加样回收率试验

用峰面积计算含量并进行分析,结果见表3。试验表明本法测定红景天苷原料药中的红景天苷及其有关物质含量准确度高。

表3 红景天苷及有关物质的回收率测定结果(n=3)

2.8 样品的测定

用峰面积计算含量,其结果见表4。

表4 红景天苷及有关物质的含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 在多成分含量同时测定中,检测波长的选择非常关键。对红景天苷、淫羊藿次苷D2(Imp 1)、4-乙酰基苯酚-β-D-葡萄糖苷(Imp 2)和云杉素(Imp 3)对照品溶液进行全波长扫描,其最大吸收峰波长分别为 275、270,280nm,和265nm,在上述色谱条件下,分 别于 230、254、275、295nm 和315nm处对供试品溶液进行分析,结果275nm处所得的HPLC图谱上各成分峰分离效果较好,且3个有关物质峰响应值(或峰面积)达到最高。故选择275nm为检测波长。

3.2 流动相比例的选择 分别采用甲醇/水(12/88,v/v)、甲醇/水(13/87,v/v)、甲醇/水(15/85,v/v)作为流动相,进行测定,结果发现流动相比例的变化对分析时间影响较大。在不影响所有目标分析物之间分离度的情况下,使用后一种比例的流动相,整个分析时间比前两者缩短近四分之一。故最后确定流动相甲醇/水的比例为15/85。

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