秋水仙素在园艺植物多倍体育种中的应用研究进展

赵阳 黄韬

（辽宁省大连市农业科学研究院 116036）

采用染色体加倍的方法选育作物新品种的途径称为多倍体育种。园艺植物的多倍体育种可以高效率改变园艺植物的某些性状，如利用无性繁殖避免因基因重组分离改变品质、通过多倍体的巨大性提高产量、对非种子食用器官的瓜果进行三倍体无籽植株的获得来增加商业价值等，说明多倍体育种在园艺植物育种中具有重要作用。本文就近年来有关秋水仙素对植物进行多倍体诱导的文献报道进行了综合概述。

1 多倍体育种在园艺植物中的应用

多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。据统计，高等植物中的多倍体占65%以上，如小麦、烟草、棉花、马铃薯、甘蔗等都是自然形成的多倍体。在被子植物中约50%是多倍体、豆类植物18%是多倍体。自1937年Blackeslee和Avery利用秋水仙素诱导蔓陀萝四倍体获得成功后，已在1000多个植物种中获得了人工多倍体。常见的多倍体果树有三倍体苹果、多倍体柑橘、三倍体梨、多倍体葡萄、四倍体金丝小枣、多倍体猕猴桃等。三倍体和四倍体的蔬菜有西瓜、白菜、甜瓜、马铃薯、茼蒿、黄花菜、辣椒、甘蓝型油菜、黄瓜、番茄、不结球白菜、花椰菜、芹菜、萝卜、莴苣、菠菜、丝瓜、石刁柏、生姜、茄子、芦笋等；花卉中常见的有四倍体金鱼草、四倍体麝香百合及多倍体的库拉索芦荟、药用百合、菊花脑、君子兰、花叶绿萝等。

1.1 多倍体育种在果树上的应用

利用多倍体可孕性低来获得无籽或少籽果实。果树可以进行无性繁殖，经过多倍体诱导后植株产生的多倍体效应可以被稳定的利用，获得三倍体无籽果实以改良果实的品质。

1.2 多倍体育种在蔬菜上的应用

在蔬菜的多倍体育种应用上最为著名的是三倍体无籽西瓜，三倍体西瓜无籽的特点被广泛地应用于西瓜育种方面。多倍体的巨大性在蔬菜上也表现显著，对以营养体为商品部分的蔬菜作物来说，由细胞染色体加倍带来的性状变化是有利的。

1.3 多倍体育种在花卉上的应用

花器作为花卉的主要观赏部位，通过多倍体育种的方法可育成1批具有较高观赏价值的花卉品种。人工诱导后的花卉品种多具有巨大性、可繁性低、适应性强、光合速率高等优势。

2 秋水仙素加倍法的应用

秋水仙素是微管特异性药物，由于适宜浓度的秋水仙素能破坏纺锤丝的形成，因此可使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍。

2.1 秋水仙素的处理方法

多倍体除了自然发生外，也可以通过人工方式诱导。常见的方式是物理和化学方式。物理方式有温度激变、机械创伤、电离辐射等。化学诱导以N-亚硝基-二甲脲和秋水仙素效果最好。

2.1.1 实体人工加倍处理法 普遍采用的方法有注射法、涂抹法、浸种法及包埋法。在君子兰、菊花脑、油菜等植株上运用浸种法诱导出了多倍体，其缺陷表现在有效诱导效率低、毒害大、缺氧致死等方面；在成龄桑上用注射法诱导成功四倍体植株，其缺陷表现在针头易刺伤生长点，造成生长点腐烂死亡，诱导率低；对甜菊采用涂抹法诱导多倍体植株，虽可避免机械损伤，但药剂与生长点难以完全接触；在生姜上使用脱脂棉包埋生长点法进行多倍体诱导则克服了以上许多问题。

2.1.2 离体培养加倍法 随着组织培养技术的发展，染色体加倍可以在离体组织培养条件下利用秋水仙素诱导单个体细胞染色体加倍，获得多倍体再生。这一方法可以克服常规人工加倍处理方法的缺陷，容易控制实验条件，减少或避免倍性嵌合体。离体材料一般是愈伤组织、茎尖、茎段、根尖组织、胚状体或用子房、原生质体。离体条件下染色体加倍的途径有：（1）先用秋水仙素溶液处理培养材料，然后转入分化培养基；（2）在含秋水仙素的离体培养基培养一段时间，诱导加倍，再转入分化培养基。陈新民等使用胚培养后加倍和浸根加倍处理两种方法都获得了较明显的加倍效果。利用组织培养的方法我国已获得了苹果、葡萄、芦笋、百合、大蒜、西瓜等园艺植物的多倍体材料。

2.2 秋水仙素的浓度和处理时间

秋水仙素的浓度和处理时间是影响染色体加倍的最重要的外在条件。用秋水仙素水溶液处理外植体时，关于浓度和处理时间的最适宜组合问题尚有不同看法。染色体加倍的原理是化学药物能够破坏、阻止纺锤丝的形成。没有纺锤丝参与，染色体复制和分裂虽然正常，但分裂开来的单体却因分裂而加了倍。由于这种加倍原理，导致了不同植物在不同浓度及处理时间产生的效果不同，有些学者认为低浓度长时间的组合较好，但还有些学者则倾向于高浓度短时间的组合。由于不同来源的外植体对秋水仙素的反应、耐受能力及敏感程度不同导致不同作物有其适当的组合性。在对莳菜加倍时，适宜的秋水仙素浓度为100mg/L，处理时间为10～14d；生姜的染色体加倍适宜浓度为30mg/L，处理时间5d；小麦产生小麦单倍体的染色体加倍适宜浓度为500mg/L，处理时间为24h；菊花脑染色体加倍适宜浓度为50mg/L，处理时间为48h；葡萄染色体加倍适宜浓度0.4%～0.6%，处理时间48～72h；葡萄二倍体玫瑰香品种进行四倍体诱导的适宜浓度为0.2%，处理时间45h；嘎拉苹果的染色体加倍适宜浓度为0.5%，处理时间为96h；蓝莓的染色体加倍适宜浓度为0.025%，处理时间24～48h；甜椒花药染色体加倍适宜浓度为0.1%～0.2%；草莓茎尖染色体加倍的适宜浓度为200～400mg/L，处理时间为 20～30d；马铃薯染色体加倍适宜浓度为0.2%～0.3%，处理时间 12～48h；西瓜染色体加倍适宜浓度0.05%；黄花菜的染色体加倍，用0.05%浓度的棉花对带芽状突起的球状体进行覆盖，并将其转移到0.02%～0.05%的固体培养基进行培养效果最佳；猕猴桃染色体加倍的适宜浓度为200mg/L，处理时间为7d；小叶绿萝同源多倍体诱导适宜浓度为0.05%，处理时间3d；苎麻多倍体育种适宜浓度0.1%～0.25%,处理时间12～24h；坚尼草的染色体加倍适宜浓度为0.1%，对种子的处理时间为4h；皇家嘎拉苹果多倍体诱导的适宜浓度为25mg/L，处理时间为5d；芦笋的多倍体诱导适宜浓度为0.1%，处理时间为12h；菠菜种子染色体加倍浓度为0.4%，处理时间为12h；黄瓜干种子多倍体诱导的适宜浓度为0.35%，处理时间为48h；辣椒幼苗滴心处理进行染色体加倍适宜浓度为0.2%，处理时间7d；茼蒿染色体加倍时滴苗处理适宜浓度为0.1%～0.2%，处理时间为48h；药用百合丛生芽进行染色体加倍诱导的适宜浓度为0.1%，处理时间72h；库拉索芦荟对试管苗的多倍体诱导适宜浓度为0.06%，处理时间12h，对茎段、叶片进行覆棉处理的适宜0.02%，处理时间48h。

秋水仙素处理的浓度和时间因处理对象的不同而异，材料质密溶液渗透慢时，应适当延长处理时间。据报道秋水仙素浓度在0.01%～1.0%内都是有效的，最常用的浓度为0.2%，在对某一植物作初次诱导试验时，一般采用高浓度短时间的处理方法。对于园艺植物来说，果树和观赏树木多用较高浓度（1.0%～1.5%）,而草本的蔬菜和花卉则应用较低浓度（0.01%～0.2%）。

3 多倍体的鉴定方法

经过秋水仙素处理以后，有些材料的染色体加倍，有些未发生加倍，还有些为嵌合体。而因其加倍效果的鉴定是倍性操作的重要一步。目前的鉴定方法主要有以下几种。

3.1 形态鉴定法

植物体细胞染色体加倍后，分化生成多倍体植株，一般表现为巨大性。通常茎变粗短，叶片变厚，有时比较粗糙或生皱纹，多毛，花朵、果实和种子变大，生育期延长，整个植株变成巨型，这些特征都可作为判别多倍体的依据。

3.2 气孔鉴定法

根据气孔保卫细胞中的叶绿体数目、单位面积的气孔数目、气孔的长度和宽度鉴定多倍体。应以叶绿体数目和气孔密度为主，用气孔大小作为参考。

3.3 花粉粒鉴定法

根据花粉粒的大小及不同花粉数目可鉴定倍性，一般四倍体的花粉比二倍体大1倍；通过观察比较再生植株花蕾与花的大小、花粉形成与结角等形态特征可鉴别二倍体与单倍体。

3.4 染色体数目鉴定法

尽管早期可以通过上述3种方法初步鉴别出多倍体，但要断定为多倍体还要进行进一步的鉴定，多采用植物组织培养物的染色体制片技术进行染色体计数，该法是到目前为止最为直观准确的鉴定方法。现在已有报道，通过细胞光度仪来测定单个细胞的DNA含量，然后根据DNA含量比较来推断细胞的倍性水平。如Owen通过流式细胞仪分析马铃薯单元单倍体和多倍体DNA含量，Nokamura用普通光学显微镜分析四倍体叶面与二倍体叶面的相对含量；Wan对玉米的诱导结果进行鉴定分析。

4 前景展望

在今后的植物多倍体诱导育种中，尤其是当某一亲本具有不利的细胞质基因时，利用该法通过调整亲本的倍性，对克服远缘杂交不孕性、远缘杂交的不实性、创造远缘杂交育种的中间亲本及培育作物新品种等方面仍有积极的作用。因多倍体的产生受外植体的生长状态、倍性水平以及秋水仙素的处理时间、浓度、温度和渗透剂的影响。要使秋水仙素诱导多倍体成为一项成熟的技术，还需在更多植物上开展广泛的研究。尤其是外植体的生长状态，对加倍效果的影响机理有待于进一步的研究。