肝细胞多倍体发生机制及其与肝细胞癌形成的相关性研究进展

汪 楠，郝风节，王俊青

（上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科，上海 200025）

多倍体是指细胞中存在2 套以上的染色体组。在自然界中，多倍体现象广泛存在，常见于植物类、鱼类、两栖动物类，但在哺乳动物中少见。正常生理状态下，人体多倍体细胞一般仅见于心脏、骨髓、肝脏等特定组织和器官。其中，已证实肝细胞多倍体与肝脏再生、稳态、终末分化、衰老等相关，但关于其具体功能和作用机制目前尚未明确。

原发性肝癌是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤。根据2018 年公布的全球肿瘤流行病学统计数据，全球肝癌的年新发病人数达84.1 万人，居恶性肿瘤第6 位，年患病死亡数达78.2 万人，居恶性肿瘤第2 位。原发性肝癌在我国高发，我国肝细胞癌（肝癌）年新发病例占全球的55.4%，年死亡人数占全球的53.9%,位居常见恶性肿瘤的第4 位和肿瘤致死病因的第2 位[1-2]。肝脏是人体最大的消化器官和多倍体器官。近年来，越来越多的研究提示多倍体细胞可能参与了肿瘤的发生、发展过程，包括多种人类肿瘤的癌前病变和恶性转化。因此，研究多倍体肝细胞与肿瘤发生、发展的相关机制，对肝癌的预防、早期诊断和治疗具有重要的研究和临床转化意义。本文就多倍体肝细胞的形成机制、功能及病理生理学意义进行阐述，深入探讨多倍体肝细胞在肝癌发生、发展中的研究进展。

多倍体肝细胞的形成机制

人体细胞除生殖细胞外，细胞内染色体组通常以二倍体形式存在并发挥生物学功能。在不同生理或病理条件下，二倍体生物可通过多种途径和机制在特定组织或器官中形成多倍体细胞。二倍体生物形成多倍体细胞的途径大致包括细胞融合、细胞核内复制和细胞质分裂失败3 种形式[3-4]。

一、细胞融合

细胞融合是指2 个单核二倍体肝细胞（2n）融合在一起而产生一个双核四倍体肝细胞（2×2n）。就人类肝细胞而言，当肝细胞形成细胞融合时，双核四倍体肝细胞保留了正常进入分裂周期的能力，可产生2 个单核四倍体肝细胞（4n）。在此基础上，单核四倍体肝细胞进一步多倍体化，则可形成双核四倍体（2×4n）或单核八倍体肝细胞（8n）[5]。研究表明，在肝脏嵌合体小鼠模型中可观察到肝细胞间细胞融合现象。然而，由于细胞外囊泡可能形成伪影干扰细胞倍性的观察，对于肝脏中肝细胞融合的存在目前仍有争议[6]，尚有待进一步深入探讨。

二、细胞核内复制

细胞核内复制是指细胞在不发生有丝分裂的前提下，细胞内发生多次DNA 合成，从而产生细胞多倍体化的细胞学现象。在生理条件下，哺乳动物的细胞周期可分为G1期、S 期、G2期和M 期4 个连续阶段，该过程受细胞周期蛋白依赖性激酶等严密调控。多项研究表明，采用敲除特定细胞周期调节基因，能够在相应的细胞周期进程中影响肝细胞多倍体化，进而建立富含不同细胞倍性的肝细胞小鼠模型，如敲除p53[7]、p21[8]、Rb[8-9]，可分别诱导不同细 胞周期阶段的细胞形成多倍体肝细胞。持续的DNA 损伤可触发肝细胞核内复制，可促使多倍体肝细胞的生成[10-11]。研究显示，体外培养的肝细胞经一定时间的紫外光照射后，在细胞周期S 期和G2期中，表现出共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3 相关激酶高度磷酸化和氧化应激反应，同时经ATR/p53/pRb 通路，促进细胞周期抑制因子p53 和pRb 蛋白高表达，进而抑制细胞周期，产生多倍体肝细胞[10-11]。

三、细胞质分裂失败

细胞质分裂是细胞分裂的最后环节，包括细胞分裂后期纺锤体重组、分裂沟的形成、中心体结构的脱落等环节。细胞质分裂失败会产生双核多倍体细胞，同样细胞质分裂失败后，如出现细胞核重新融合，也可能导致单核多倍体细胞形成。

1.PI3K/AKT 信号转导途径：就哺乳动物肝细胞而言，细胞多倍化起始于断奶期间[12]，与高脂饮食及高水平胰岛素、AKT 信号增强密切相关[5,12]。胰岛素经PI3K 信号通路进行调节，PI3K/AKT 信号通路是胰岛素作用的主要下游通路。研究显示，PI3K/AKT 信号通路在细胞迁移中发挥促使肌动蛋白细胞骨架极化和重组的作用，该通路各环节发生的变化均可能导致肝细胞质完全分裂失败，进而形成多倍体细胞。

2.E2F 家族：E2F 家族是细胞周期进程的主要调节因子[13]。研究表明，该家族的E2F7 和E2F8 基因双敲除的小鼠模型肝脏中富含二倍体肝细胞（基因敲除小鼠模型的肝细胞中二倍体肝细胞占60%～70%，而对照组肝细胞中则占3%～4%）[15-16]。在肝细胞多倍体化过程中，可观察到E2F7 和E2F8 的表达水平显著升高，表明其参与了细胞多倍体化的调节。E2F1 基因具有抑制细胞多倍体化的作用，E2F1 基因缺失，可导致细胞G2期和M 期转录效率下调，促进多倍体细胞形成[14]。

3.微小RNA（microRNA，miRNA）：Hsu 等[15]发现，miRNA与双核多倍体肝细胞的形成间关系密切。在miR-122 基因敲除的小鼠模型中观察到，肝细胞多倍体总量减少60%～70%。在此基础上进一步研究显示，miR-122 下调在诱导减少肝细胞多倍体化的同时，具有促进肝细胞癌发生的作用，提示miR-122 可能作为肝癌治疗的潜在靶点，而与其相关的肝细胞多倍体化改变可能与肝癌发生、发展密切相关[16]。

多倍体肝细胞生理功能和意义的假说

正常生理状态下，肝脏细胞多倍体化仅是肝脏生理发育的表现形式，还是具有一定的生物学意义,结合目前的理论，已有几项假说支持肝脏细胞多倍体化具有特定的生物学意义。

一、肝细胞多倍体化与肝脏细胞的终末分化及衰老有关

最早的研究认为，在啮齿类动物和人类中，肝细胞多倍体化与肝细胞终末分化及衰老有关。既往研究提示，肝细胞多倍体化伴随着肝细胞的终末分化、增殖能力和细胞分裂功能的下降[20]。然而最近研究表明，多倍体肝细胞虽然可能与细胞衰老进程的加速相关，但多倍体肝细胞仍保留了分裂和增殖的能力，因此认为肝细胞多倍体不属于细胞分化的终末形式。Pandit 等[17]提出，E2F8 基因敲除的小鼠其肝脏主要由二倍体肝细胞组成，其肝脏的再生能力与具有大量多倍体细胞的野生型小鼠肝脏间没有差异，有力地支持了上述观点。同样，Knouse 等[18]、Miyaoka 等[19]、Miettinen 等[20]发现，在部分肝切除术后，多倍体肝细胞的分裂程度与二倍体亦相同；Duncan 等[21]把成年小鼠的二倍体和八倍体肝细胞移植到延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷的小鼠肝脏内，结果发现，二倍体和八倍体肝细胞具有同等的再增殖潜力，说明多倍体肝细胞均具有相当高的增殖能力。

二、多倍体肝细胞具有增强和稳定肝细胞功能的作用

多倍体肝细胞具有多套染色体组。新近观点认为，多倍体细胞相应的基因在转录过程中能够成倍增加，籍此导致特定代谢功能的增强[21-22]。Lu 等[23]早在2007 年就使用微阵列分析观察了来自野生型小鼠的不同核倍体数肝细胞的基因表达谱，仅发现了在不同人群之间的基因表达谱中存在一些差异。Kreutz 等[24]的研究发现，二倍体肝细胞与单核多倍体肝细胞的基因表达谱不同，而与双核多倍体肝细胞的基因表达谱相近。上述发现提示，肝细胞核倍体数的增加可能提高肝细胞的生物功能。Miettinen 等[20]应用周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1,CDK1）基因敲除的小鼠建立了单核多倍体肝细胞模型，研究较高的细胞核倍体数与肝细胞代谢之间的关系，结果表明，较高的肝细胞核倍体数会诱导线粒体相关基因和脂质从头合成途径相关基因表达水平下降，同时诱导细胞骨架、糖酵解基因表达水平升高，说明多倍体肝细胞具有促进肝脏代谢功能的作用。

肝脏具有较高的能量需求，细胞多倍体化后功能的增强可能有助于其快速适应环境改变带来的生物学压力。Bahar等[25]采用基于单分子荧光原位杂交技术方法，定量分析了肝细胞内特定启动子的活化状态，发现基因转录过程中转录效率、转录频率等存在不稳定性，启动子在活化和关闭状态之间随机切换，并诱导细胞基因表达围绕一定的值上下波动，即形成“转录噪声”。值得一提的是，多倍体肝细胞的转录噪声很小，表明肝脏多倍体化参与了转录噪声产生的严格调控和有效缓冲，使基因表达趋向稳定，并在此基础上保持肝细胞发挥稳定的生理功能[22,26]。

三、多倍体肝细胞促进肝组织修复及抵抗基因毒性损伤

肝脏是人体中最为重要的再生器官，同样也是为数不多的多倍体细胞占总体细胞一半以上的器官。研究表明，对小鼠肝脏施行部分切除后，其残余肝组织中的多倍体肝细胞发生明显增殖，并参与了肝组织的再生。Zhang 等[27-28]建立了E2F7 和E2F8 双敲除二倍体肝脏小鼠模型，并对其进行部分肝切除，结果发现，与野生型小鼠肝脏（多倍体肝细胞）部分肝脏切除后的肝组织再生能力比较，多倍体肝细胞在修复受损肝组织方面能力明显高于二倍体肝细胞。同样，使用四氯化碳毒素处理野生型小鼠与E2F7、E2F8 双敲除小鼠，获得小鼠肝损伤模型，对比2 种小鼠处理后的肝脏体积和重量，也得到了类似结果。上述发现说明，肝细胞的多倍体化对肝脏再生影响显著。

肝细胞多倍体与肝癌的关系

一、环境特异性背景下多倍体细胞与人类肿瘤

基因组学已证实，约有30%的人类实体肿瘤，如结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌等中存在大量多倍体细胞[29]。在临床病理诊断中，多倍体肿瘤细胞与肿瘤侵袭性强、恶性程度高、预后较差相关。基于此，多数学者认为，细胞多倍体化参与了从癌前病变到恶性肿瘤转变的动态过程，基因组倍性的增加极有可能是肿瘤发生的重要驱动因素[26]。Ganem 等[30]发现，将TP53 基因敲除的四倍体乳腺上皮细胞移植至免疫缺陷的裸鼠中会引起恶性肿瘤，而移植TP53 基因敲除的二倍体乳腺上皮细胞不会引起恶性肿瘤，这一发现提示四倍体会引起肿瘤发生。由于正常成年人的肝脏在生理状态下富含大量多倍体细胞，故多倍体在肝脏肿瘤发生中的作用目前尚无法解释。对于多倍体细胞在肝脏中是促进肿瘤产生的因素还是抑制肿瘤恶性转化的保护因素，不少学者展开了讨论。

二、多倍体肝细胞对肝细胞肝癌发生、发展的潜在抑制作用

1.抑癌作用机制研究：根据前述提出的观点，细胞多倍体化一般是肿瘤发生和发展的关键因素。然而，研究表明，正常成年人的肝脏生理状态下有50%为多倍体细胞。关于多倍体肝细胞是否与肝癌发生、发展相关，是否也具有促进肝癌发生的作用的问题，这值得探讨。与大多数人类实体肿瘤相关研究不同，现有研究结果显示，多倍体肝细胞具有拮抗肝癌发生、发展的作用。理论上，二倍体组织内的细胞通过经典的杂合性丢失机制可导致恶性肿瘤的发生，即在2 个成对的抑癌基因中，1 个或2 个等位基因出现不同的基因组变化，可导致其失去抑制细胞转化为癌细胞的功能。相反，多倍体肝细胞最多可以包含16 个等位抑癌基因，因而对抑癌基因的丢失或者突变具有缓冲作用。现阶段，有关肝细胞多倍体抑制肝癌发生的假说中，以下研究结论最被广泛接受。这些研究提出，细胞多倍体化可以增加单细胞基因数目，保护细胞免受遗传毒性机制的损害[28,31,34]。该研究者分别通过控制小鼠断奶时间和Anln 基因、E2F8 基因的水平，建立了Anln 基因敲除小鼠模型 （肝细胞大多数为多倍体）和E2F8 基因敲除小鼠模型（肝细胞大多数为二倍体），随后用二乙基亚硝胺建立了肝癌诱导模型。结果表明，多倍体细胞占优势的肝细胞组成状态在多种肝癌模型中均显示出肿瘤抑制功能。进一步研究显示，多倍体肝细胞抑癌作用与缓冲抑癌基因突变或缺失有关，而并非抑制肝细胞在致癌性因素作用后的异常细胞增殖[27,30]。

作为上述假说的理论支持，Knouse 等[18]对E2F8 基因敲除小鼠和野生型小鼠分别进行了部分肝切除手术，结果发现，与野生型小鼠相比，以二倍体为主的E2F7、E2F8 双敲除小鼠术后的肝脏质量恢复率更高。另外，Wilkinson 等[32]从小鼠肝脏中直接提取肝细胞进行原代细胞培养，发现其中以二倍体为主的E2F7、E2F8 双敲除肝细胞的增殖率明显高于野生型多倍体肝细胞。上述结果提示，二倍体肝细胞增殖能力大于多倍体肝细胞，而多倍体肝细胞可能因其抑癌基因获得多次复制机会，具备明显的抑制肝癌作用。

2.与预后的相关性：多倍体肝细胞的不同细胞核状态也与肝癌患者的预后相关。2019 年，Bou-Nader 等[33]利用肿瘤细胞原位成像的方法，分析了肝癌患者与健康对照者肝组织的细胞倍性谱，结果显示，在人体肝癌发生过程中，双核多倍体百分比及细胞倍性大大降低 （正常组织中约为15%，而肿瘤组织中约为5%）。相反，单核多倍体百分比及细胞倍性在肝癌中上升（正常组织中约为12%，而肿瘤组织中约为33%）。因此，单核多倍体肝细胞可能与低分化、增殖率高、预后不良的肝癌有关。

值得关注的是，在哺乳动物出生后的发育过程中，绝大部分肝细胞通过细胞质分裂失败的形式生成双核多倍体细胞。Bou-Nader 等[33]发现，双核多倍体肝细胞在人类肝癌中几乎不存在，强烈提示恶性肝细胞分裂时不存在细胞质缺陷，为之后的研究提供了方向。除此之外，Bou-Nader 等[32]的研究结果也支持了Zhang 等[28,34]和Lin 等[31]的假说。

虽然多倍体肝细胞与肝癌的关系仍未完全阐明，但多倍体肝细胞对肝癌发挥抑制作用观点已逐步被研究者所接受，细胞质分裂机制与癌细胞增殖之间的分子联系是当前研究的热点。Anln、E2F 等基因涉及细胞有丝分裂多个环节，将是进一步深入探讨的重要领域。前述的miRNA-122 也为研究者从非编码RNA 着手研究肝细胞多倍体与肿瘤的关系，提供了另一种研究思路[15-16]。

结论和展望

多倍体形成是一种特殊的细胞功能机制，其产生原理和生物学意义尚待深入阐述。多倍体细胞在人体生理发育过程中必不可少，肝脏作为人体最大的多倍体器官，肝细胞多倍体化贯穿于肝脏发育、生长、再生及衰老的全过程中。明确肝脏多倍体与肝癌间的关系，以及肝癌究竟是来自于多倍体还是二倍体肝细胞，将为之后的临床肝癌预防、诊断、治疗提供重要理论支持。全面揭示多倍体肝细胞抑制肝癌发生、发展的具体机制，将推动肝癌精准治疗的开展。此外，尚可进一步探讨以下相关问题，如肝细胞倍性能达到的极限；多倍体肝细胞如何实现细胞增殖；多倍体肝细胞如何解决有丝分裂期间形成的多极纺锤体[18,20]等。