基因甲基化研究概述

程永波综述 房殿春 易 滨审校

表观遗传学(epigenetics)反映的主要是基因型和表型的关系。研究范围包括:DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、遗传印记、X染色体失活、RNA调控、转座元件、副突变、位置效应斑、等位反式互补等[1～5]。近年来研究较多的是胞嘧啶 DNA甲基化、RNA干扰(RNAi)调控、组蛋白修饰 3种,尤其是 DNA甲基化。2003年欧洲 HEC宣布实施人类表观基因组计划(HEP),以指导和系统地研究 DNA基因甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的作用[6]。本文就现阶段对DNA甲基化研究的基本现状作一概述,以获得 1个整体认识,从而在此基础上对其作进一步研究。

1 CpG岛

DNA甲基化多发生于 DNA链上胞嘧啶第 5位碳原子,其与甲基共价结合,胞嘧啶由此被修饰为 5甲基胞嘧啶(5mC),哺乳动物基因组中 5 mC占胞嘧啶总量的 2% ～7%,70%～90%的 5mC存在于CG二联核苷。CG在DNA中呈回文结构,通常称为 CpG(p表示磷酸基),中文为磷酸胞苷酰[7]。哺乳动物中,CpG序列在基因组中出现的频率仅有 1%,远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中,CpG序列密度很高,可以达均值的 5倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,形成所谓的 CpG岛。CpG岛大小说法不一,但范围在 0.5～2 kb之间,通常大约为 500多个碱基,CG含量超过 55%。其主要特征为:主要位于基因启动子区,少数位于第一外显子区;在所有正常组织中通常是非甲基化的,看家基因的启动子都含有CpG岛,且都是非甲基化的,组织特异性基因缺乏这样的结构;一旦受相关因素影响发生甲基化可直接导致相关基因的表观遗传学基因沉默,而基因下游即非岛区 CpG甲基化则不抑制基因的转录;启动子区 CpG甲基化的密度与转录的抑制程度相关,CpG甲基化的密度增加转录会被完全抑制[8]。正是由于上述特征,DNA甲基化的研究多集中在启动子区的CpG岛。

2 DNA甲基化分类及甲基化酶

DNA甲基化分维持甲基化和从头甲基化(又称构建性甲基化)。前者是在甲基化DNA半保留复制出的新生链相应位置上进行甲基化修饰的过程,新生链只在与母链甲基化位置相同的碱基处发生甲基化;后者是在原来没有甲基化的DNA双链上进行甲基化的过程,原本甲基化全去甲基化后又重新甲基化也属此类。不管是维持甲基化还是从头甲基化,在将S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)提供甲基添加到DNA分子中的过程中,都需要 DNA甲基转移酶(DNMTs)的参与。DNA甲基转移酶有 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 3种。DNMT1功能是 DNA复制维持甲基化[9],分子量约 193500,含有具催化作用的 C端和结合与调节功能的N端,定位于 19p 13.3-p13.2,其缺失将导致胚胎发育异常及死亡。DNMT3a和DNMT3b功能主要是从头甲基化,两者起协同作用。DNMT3a定位于 2p23,DNMT3b定位于 20q11.2,这两种酶催化在发育过程中去甲基化的 CpG位点从头甲基化。两者的基因变异可影响正常发育。DNMTs活性增加可使DNA发生异常甲基化、基因活性改变和染色体不稳定。实验表明,DNMTs在增生细胞里的水平高于静默细胞,瘤细胞里的DNMTs表达更高且有提高恶性细胞对周围组织侵袭的能力[10]。

在癌细胞中,DNMT基因表达增高往往先于高甲基化变化,因此可以认为DNMT活性增高是癌细胞的1个具有特征性的早期分子改变。DNMTs正因为与肿瘤发生发展的这种相关性,所以成为目前DNA去甲基化恢复抑癌基因功能的热点靶向分子。

DNA去甲基化酶有两种类型:位点特异性和总基因组 DNA去甲基化酶,目前对它们的了解甚浅。

3 DNA甲基化模式

DNA甲基化在不同组织具有不同模式。脊椎动物正常组织基因的甲基化状态有 3种:持续的低甲基化状态,如管家基因;去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因;高度甲基化状态,如女性的一条失活的 X染色体。在肿瘤组织中的模式是普遍的低甲基化和高甲基化并存,即基因组广泛低甲基化和局部CpG岛的高甲基化,这种变化可在同一肿瘤中同时发生,总体来说甲基化水平是降低的,目前尚不清楚这种现象是同一作用机制产生的共同结果还是来源于肿瘤发生过程中的不同机制。肿瘤组织的上述两种甲基化均发生于恶变的前期,提示基因组范围DNA低甲基化和局部CpG岛高甲基化是癌变过程中早期的分子异常之一[11～13],并在肿瘤发生过程中有着重要作用。

4 DNA甲基化的作用

DNA甲基化的功能仍不完全清楚,到目前为止比较确定的作用是调控基因表达、促进基因突变,这是机体正常发育、X 2染色质失活、基因组印迹等所必不可少的。近期研究表明DNA甲基化在DNA修复、基因不稳定性等方面也发挥潜在作用,并且发现其可以进化为 1种防御机制,抑制“寄生”DNA序列(如逆转录病毒片段)的侵入[14]。

4.1 DNA甲基化与基因表达

DNA甲基化在基因表达上的调控作用已经公认,其最终结果是导致基因的失活,即基因沉默。这种调控作用从本质上说是 1种DNA水平的调控,从效果上是直接影响基因的转录。在真核生物中,甲基化和非甲基化基因的转录活性相差可达 106倍。这种转录抑制机制主要有以下 4点:①DNA甲基化直接干扰特异转录因子和各种启动子识别位点的结合:DNA甲基化后会引起 DNA分子构象的改变从而影响特定蛋白质及其黏附能力而直接干扰两者的结合;5-甲基胞嘧啶和鸟嘌呤的解链温度比未进行过甲基化修饰的胞嘧啶和鸟嘌呤碱基对的解链温度高,影响解链;甲基化修饰改变了 DNA自身的三级结构,影响了其它序列 RNA酶的直接作用。②甲基化的DNA结合转录抑制因子引起基因沉默:CpG岛引起基因沉默的最好的例证是基因组印记和女性 X染色体的失活。③通过影响核小体的位置或与其它染色体蛋白质相互作用而改变染色体的结构,介导转录抑制。有学者发现 DNA甲基化后与组蛋白结合得更紧,核小体结构更紧密,并且 75%的甲基化 CpG结合在核小体核心上,仅少量分布在核小体间的连接区,而活跃基因的敏感区是低甲基化的。④MeCP2的作用。1989年有学者发现 1种活性物质与甲基化的 DNA有特异亲和力,命名为 MeCP1和 MeCP2。后者是第 1个真正能选择性识别甲基化CpG的蛋白质家族成员,是由 1条单链多肽组成的染色体相关核蛋白,与甲基化 DNA结合所需要的最小区域命名为甲基-CpG-结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD),可选择性结合甲基化 DNA。MBD的 1个重要功能是抑制转录,可在体内外与甲基化的基因启动子结合而抑制转录[15],对于非甲基化的启动子则不能抑制其转录。与MeCP1不同,MeCP2仅能结合包含 1个 CpG对的 DNA,而 MeCP1则只能结合高密度甲基化的DNA[16]。

对于 DNA甲基化可以引起基因沉默也有不同的观点,有学者认为 DNA甲基化可能不是基因沉默的原因,而是结果。从时间上看往往是先基因沉默,然后才出现甲基化现象,甲基化只是用来标识沉默基因的,并同时向结合蛋白给出信号,防止转录因子与启动子结合,协同抑制基因表达。

4.2 DNA甲基化与基因突变

DNA甲基化可以促进基因突变,因为 5′甲基胞嘧啶可自发或在 S-腺苷蛋氨酸的作用下引起邻位脱氨而变为胸腺嘧啶,导致 G/T错配,如果未修复即为 G—T点突变。这是最常见的突变,在抑癌基因p53中也最常见,可以认为是肿瘤相关基因甲基化促进细胞恶变的 1种机制[17]。

5 DNA甲基化与其它表观遗传修饰和环境的关系

DNA甲基化与其它表观遗传修饰之间存在密不可分的关系,与外界环境也存在千丝万缕的因果联系。

5.1 DNA甲基化与其它表观遗传修饰之间的关系

DNA甲基化与组蛋白的修饰和染色质的重塑可以看作是 1个整体,共同对基因表达起调控作用。近来有不少学者已经将DNA甲基化和组蛋白去乙酰基作用两种机制联系起来进行研究,目前已证实 DNA甲基化与组蛋白去乙酰化呈正相关,而在通常情况下含有 CpG岛的染色质一般被高度乙酰化,缺乏组蛋白 H 1,包含 1个无核小体区域[18～21]。

5.2 DNA甲基化与DNA损伤的关系

DNA甲基化与 DNA损伤有关,后者可引起低甲基化。烷化剂可以诱发各种细胞的 DNA损伤,在这种应急状态下,细胞可通过多种途径降低细胞 DNMT1水平,从而导致全基因组低甲基化。低甲基化有可能是细胞对DNA损伤的即时适应反应,同时也是细胞癌变启动阶段的早期现象[22]。细胞癌变有可能是正常细胞在遭受非致死性DNA损伤等打击条件下,其原始的被抑制的SOS应急机制被激活,基因组低甲基化则是这种应急反应的组成部分。这种低甲基化可能有利于启动细胞潜在的容错机制,甚至是恢复细胞潜在的增殖能力。这些反应使得细胞免于凋亡而呈 1种类胚胎化过程[23]。

有些致癌物并不损伤DNA而导致去甲基化,如砷可诱发cmyc基因低甲基化而使其表达上调。砷在代谢过程中需要高度甲基化,其甲基供体同样是 SAM,由于竞争而使基因组整体甲基化水平低下。

5.3 DNA甲基化与膳食因素的关系

膳食因素对DNA甲基化有各种不同的复杂影响,如叶酸、维生素B12等[24,25]。人体所有的甲基化反应所需甲基基团均来自食物中的甲基供体或携带一碳单位的代谢组分,如甲硫氨酸、甲基叶酸、氯化胆碱,三者在体内的代谢相互依存。叶酸是一碳单位代谢过程中的中心角色,其经过多级还原反应,最后形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),SAM将其甲基基团提供给细胞中 80多个生物甲基化反应。叶酸缺乏引起的 DNA甲基化改变相当复杂,其根据细胞类型、靶器官、细胞转化所处的不同阶段、个体遗传背景发生变异,同时还表现基因和DNA位点的特异性,这可能与DNA损伤引起DNMT1变化特性有一定联系。通常情况下,叶酸缺乏在引起 DNA链损伤、异常碱基掺入、基因组整体甲基化水平下降的同时伴有DNMT1活性的提高和局部CPG岛的超甲基化。过度摄入叶酸和SAM的前体甲硫氨酸时有可能引起CpG岛的超甲基化和看家基因的沉默。

维生素 B12对DNA甲基化也有影响,在血液中的主要形式是甲基钴氨素(MeCb1),甲基钴氨素有可能是除SAM的第二途径的甲基基团提供者。

6 DNA甲基化的临床意义及检测

基因启动子异常甲基化在许多肿瘤发生过程中是 1个频发的早期事件,因此可以作为癌症预防、早期检测、疗效预测、抗癌剂筛选等分子生物标志,其中癌变细胞可以释放DNA到外周血中,因此可以用外周血为样品检测相关基因的启动子异常甲基化,为肿瘤的早期诊断提供有价值的信息[26～28]。

经过几十年的研究,DNA甲基化检测方法和分析手段不断进步,不断成熟,并且日趋简单快捷,到目前为止至少已报道了三类十多种此类方法。主要的有甲基化敏感的限制性内切酶法、基因组直接测序法、基于重亚硫酸盐处理基础上的测序、甲基化特异性 PCR(MSP)、限制性分析(COBRA)、甲基化敏感单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、PCR-RFLP、Bips等方法、甲基化敏感的单链构象分析法(MS-SSCA),与基因蕊片相结合的快速大通量分析法等[29～32],不同的方法各有利弊,已有多位学者对此领域的研究进展做了详细总结,在此不再赘述。

综上所述,DNA甲基化是 1种高于基因组序列水平的基因表达调控机制,是在表观基因组水平精确研究正常和疾病组织DNA甲基化模式的特征和差异,揭示如肿瘤等疾病的表观遗传学机制,并将DNA甲基化模式的改变与基因沉默、年龄相关变化和疾病特异性改变联系在一起,是 1个很有前景的研究领域。经过六十多年的研究发展,对 DNA甲基化的模式、作用等已有了相对深入的认识,但目前对甲基化与去甲基化的分子机制、正常甲基化与去甲基化平衡如何维持等等问题仍没有完全研究清楚,这也许是以后需要进一步努力的方向。

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