河南汉族人群血小板膜糖蛋白IaC807 T基因多态性及其对血小板聚集功能的影响

刘伟,鲁广秀#,许予明,郑红

1.河南大学淮河临床学院神经内科,河南开封 475000;2.郑州大学第一附属医院神经内科,郑州 450052;3.郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室,郑州 450001

河南汉族人群血小板膜糖蛋白IaC807 T基因
多态性及其对血小板聚集功能的影响

刘伟1,鲁广秀1#,许予明2,郑红3

1.河南大学淮河临床学院神经内科,河南开封 475000;2.郑州大学第一附属医院神经内科,郑州 450052;3.郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室,郑州 450001

目的:探讨河南汉族人群血小板膜糖蛋白(GP)IaC807T基因多态性及其对血小板聚集功能的影响。方法:120例河南汉族脑梗死患者为缺血组,113例健康体检者为对照组,PCR-RELP法检测2组GPIaC807T基因多态性,体外胶原诱导法检测2组血小板聚集功能。结果:河南汉族人群GPIa基因第807位存在2种等位基因(C和T)和3种基因型(C/C、C/T、T/T);缺血组 T807等位基因频率高于对照组(P＜0.05);GPIaT等位基因携带者较C等位基因携带者体外胶原诱导下血小板达30%聚集前的延迟期缩短(P＜0.05);缺血组T基因携带者血小板达30%聚集率前的延迟期较对照组缩短(P＜0.05);血小板最大聚集率差异无统计学意义。结论:血小板膜GPI-aT807等位基因可能是河南汉族脑梗死患者的遗传危险因素,作用机制可能与血小板聚集功能的迅速启动有关。

糖蛋白;基因多态性;缺血性脑血管病;河南;汉族

#【通讯作者】鲁广秀,Tel:86-378-3155122,E-mail:lugx820@yahoo.com.cn。

血小板聚集和粘附功能异常在缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)发生、发展过程中起重要作用。血小板膜糖蛋白(glycop rotein,GP)Ia-IIa是血小板胶原受体,属整合素家族,由α和β亚单位组成,亦称α2β1整合素。GPIa-IIa在血小板活化和血栓形成过程中起关键作用[1,2],血小板通过GPIa-IIa粘附到血管内皮下暴露的胶原上,随之被活化。近年在GPIa基因转录区807(C或T)和873(G或A)位点发现2种基因多态性,且807T和873A完全连锁[3],该位点基因多态性和GPIa-IIa在血小板表面的表达水平相关[4],T807等位基因携带者具有血栓性疾病倾向。本研究观察河南汉族脑缺血或健康人群GPIa基因807C/T多态性及其与血小板聚集功能的关系,以探讨该基因多态性与ICVD的关系及可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2008年3月～2009年2月在河南省二级甲等以上医院门诊就诊或住院的ICVD患者120例为缺血组,均符合2006年WHO确定的脑卒中诊断标准,经CT或MRI证实,并排除心肌梗死及肝肾功能不良者,男73例,女47例;年龄38～75岁,平均(58.3±17.6)岁。另选择河南省二级甲等以上医院门诊健康体检者113例为对照组,男61例,女52例;年龄39～ 74岁,平均(58.2±16.8)岁。2组受试者均为河南汉族人,一般资料比较差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 GPIaC807T基因多态性检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polym erase chain reactionrestricition-fragm ent length polyMorphism,PCR-RELP)法检测。目的片断约184 bp,上游引物为:5'-GTGTTTAACTTGAACACA TAT-3',下游引物为:5'-ACCTTGCATATTGAATTGCTT-3'。PCR反应体系为25μL:2×Taq M aster M ix(含0.1 U Taq DNA聚合酶,20 mM T ris-HCL,100 mMKCL,3mM MgCL2,500μM dNTP)8μL,上下游引物分别为2μL(10mm ol/L),DNA模板2μL,加双蒸水至25μL。PCR扩增条件:95 ℃预变性5min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 m in,共35个循环;72℃延伸5 min。取PCR产物10μL,行20 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察扩增结果。酶切反应体系20μL:PCR扩增产物10μL,TaqI内切酶5 U,双蒸水 8μL。65℃水浴90min,酶切产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像仪下观察并照相,通过PCR条带判断PCR酶切产物的长度。

1.2.2 体外胶原诱导血小板聚集功能试验 所有受试者均清晨空腹肘静脉采血10 m L,取3 m L置于抗凝管(含0.5m L 0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝液)中。采血后30 min内1000 r/min离心10m in,取上层液为富血小板血浆(platelet-rich p lasma,PRP);剩余血液3000 r/min离心15m in,取上层液为贫血小板血浆(p latelet-poor p lasma,PPP)。将PRP计数,用PPP调节为25万/μL。血小板聚集采用 Born比浊法测定,I型胶原的终浓度为200μg/m L。计算血小板达30%聚集率前的延迟期及血小板最大聚集率。

1.3 统计学处理 用SPSS 11.0统计软件处理数据,计量资料以(x±s)表示,采用t检验,计数资料间比较用 χ2检验,多态性群体调查作 Hardy-Weinberg检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPIaC807T基因多态性检测结果 PCR扩增片段大小为184 bp,见图1。酶切结果显示,GPIa基因型有3种:①TT型:产物长度为 115 bp;②CC型:产物长度为92 bp;③CT型:产物长度为115 bp及92 bp;见图2。

2.2 GPIaC807T等位基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验结果 缺血组及对照组的基因型分布频率均符合H ardy-Weinberg平衡,χ2值分别为3.85及0.5292,具有群体代表性,见表1。

表1 缺血组及对照组GPIaC807T基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验(例)

2.3 缺血组与对照组GPIaC807T基因型及等位基因频率 缺血组GPIa基因T等位基因频率高于对照组(χ2=6.322,P＜0.05),见表2。

2.4 缺血组与对照组GPIa基因多态性与血小板聚集功能的关系 2组T等位基因携带者(TC及TT基因型)血小板达30%聚集前的延迟期较非 T基因携带者(CC基因型)缩短(P＜0.05),最大血小板聚集率差异无统计学意义;与对照组比,缺血组T基因携带者血小板达30%聚集率前的延迟期缩短(P＜0.05),血小板最大聚集率差异无统计学意义。

表2 缺血组与对照组GPIaC807 T基因型及等位基因频率比较

表3 缺血组与对照组GPIa基因多态性与血小板聚集功能的关系(x-±s)

3 讨论

GPIa-IIa为血小板膜上重要的胶原受体,可介导血小板粘附于Ⅰ-Ⅷ型胶原。人类动脉粥样硬化斑块主要包含I、III型胶原,I型胶原约占胶原总量的2/3。胶原可诱导血小板内侧磷脂层转移至膜表面,加快凝血酶生成,后者可刺激血小板促磷脂酶暴露,形成正反馈。在1500/s的高血流切变率下,血小板对I型胶原的粘附率在一定时间范围内(3m in)与GPIa-IIa分子水平成正比,可能与GPIa基因核苷酸807(C/T)位点多态性有关。多态性不改变GPIa氨基酸顺序,但与血小板GPIa-IIa表达水平显著相关[6,7]。Kunicki等[5]发现血小板膜GPIa-IIa的密度在健康个体间可相差4倍左右,其可能是血栓性疾病的危险因素。携带T807等位基因的个体,血小板表达高水平GPIa-IIa,携带C807等位基因的个体,血小板表达低水平GPIa-IIa。高水平的GPIa-IIa表达仅依赖于T807等位基因的存在,纯合子TT与杂合子CT表达相似数量的GPIa-IIa。因此,GPIa基因多态性可影响血小板的聚集功能[7]。

本研究缺血组GPIaT等位基因频率高于对照组;体外胶原诱导血小板聚集试验中,缺血组和对照组T等位基因(TC及TT基因型)携带者血小板达30%聚集前的延迟期均较非T基因携带者(CC基因型)缩短(P＜0.05),但二者的最大血小板聚集率差异无统计学意义。这与K ritzik等[6]观察结果一致,推测可能因CC基因型者血小板表面GPIa-IIa分子密度较低,仅能粘附于少量胶原,启动血小板聚集较慢(延迟期延长),但随着GP活化,引起血小板释放多种活性物质,如血栓素B2、二磷酸腺苷、血小板活化因子等,放大血小板对胶原的反应,导致最大血小板聚集率无显著性差异。基于本研究结果,推测T等位基因携带者,因血小板表达高密度GPIa-IIa分子,迅速粘附于大量胶原,启动血小板聚集,释放多种活性物质,促进凝血酶生成,而机体各种代偿性抗栓机制相对滞后,如内皮细胞释放内皮源性舒张因子、前列环素、组织纤溶酶原激活物及抗凝血酶-III等,引起血小板活化和血栓形成[8]。

基因多态性研究受种族、地区、样本量及研究方法的影响,国内外关于GPIa C807T基因多态性是否为脑梗死独立危险因子仍存在争议。本研究提供河南汉族人群GPIaC807 T等位基因与脑梗死的关系,推测T等位基因可能是河南汉族脑梗死患者遗传危险因素,机制可能与血小板聚集功能迅速启动有关,但研究例数相对较少,确定结论仍需大规模前瞻性研究证实。

致谢 本实验在郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室完成。

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Polymorphism of PlateletG lycoprotein IaC807TGene in Han Population of Henan Provinceand Its Ef fecton Platelet Ag-

gregation

LIU Wei▲,LU Guang-xiu,XU Yu-m ing,ZHENG Hong.▲Department of Neurolog y,HuaiHe Clinica l Hospita l A f filiated to Henan University,H enan 475000,China

Objective:To investigate the polymorphism of the plateletglycoprotein IaC807T gene in H an poplulation of Henan province and its effect on p late let aggregation.Methods:Platelet glycop rotein IaC807T gene polymorphism in 120 patients with cerebral in farc tion(cerebral in farction group)and 113 hea lthy vo lunteers(control group)from Han population of Henan p rovince have been detected using PCR-RFLP technique.The technique of co llagen type I-inducing p latelet aggregation was used to detec t the p latelet aggregation of tw o groups.Resu lts:There w ere two alleles(C and T)and 3 genotypes(C/CC/T T/T).The frequency ofGPIa T allele was significantly higher in the cerebra l in farction group than that in the control group(P＜0.05).The lag time before 30%p latelet aggregation w as significantly shorter in the sub jects with T allele than those with C allele in two groups(P＜0.05)and the lag time before 30%platelet aggregation of subjects with T allele in cerebral infarction group w as significantly shorter than those in the contro ls.How ever,there w as no significant difference of the maximal rate of platelet aggregation between them.Conclusion:The p latelet collagen receptorGPIaT807 allelem ight be a risk factor for cerebral infarction in patients in Henan province and the rapid initiation of co llagen-induced p late let aggregation may be one of themechanisms.

glycoprotein;genetic polymorphsim;ischemic cerebrovascular diseasese;Henan province;Han popu lation.

R741;R741.02

A

1001-117X(2010)01-0035-03

10.3870/sjsscj.2010.01.012

2009-11-21