维拉帕米对难治性癫大鼠的疗效及海马P-糖蛋白表达的影响

林娟霞,陈利强,孙美珍#,王明正

1.山西医科大学第一临床医学院神经内科,太原 030001;2.山西医科大学神经药理教研室,太原 030001

林娟霞1,陈利强1,孙美珍1#,王明正2

1.山西医科大学第一临床医学院神经内科,太原 030001;2.山西医科大学神经药理教研室,太原 030001

目的:观察耐药蛋白抑制剂维拉帕米对难治性癫大鼠的疗效及海马P-糖蛋白表达的影响。方法:W istar大鼠50只,随机分为生理盐水组(NS组)、匹罗卡品组(PILO组)、卡马西平组(CBZ组)、低剂量维拉帕米组(LDV组)和高剂量维拉帕米组(HDV组),氯化锂-匹罗卡品腹腔注射制作大鼠自发性癫模型,选择耐药癫大鼠,分别给予常规或添加维拉帕米抗癫治疗,观察大鼠性发作频率及海马P-糖蛋白表达的变化。结果:与NS组相比,其它4组大鼠性发作频率增高,海马P-糖蛋白表达增强(P＜0.05);LDV组和HDV组大鼠的性发作频率及海马P-糖蛋白表达较PILO组和CBZ组降低(P＜0.05);PILO组和CBZ组大鼠性发作频率及海马P-糖蛋白表达无明显差异,LDV组和HDV组大鼠性发作频率及海马P-糖蛋白表达无明显差异。结论:添加维拉帕米治疗可明显减少难治性癫大鼠性发作频率,降低难治性癫大鼠海马P-糖蛋白的表达。

难治性癫;维拉帕米;P-糖蛋白

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:成年雄性Wistar大鼠50只,体质量260～300 g,由河北医科大学实验动物中心提供。②主要试剂与材料:LiCl、PILO(购于Sigma公司),大鼠抗P-gp单克隆抗体(购于北京博奥森公司),免疫组化试剂盒(购于北京中杉金桥公司)。

1.2 方法

1.2.3 免疫组织化学染色 灌胃治疗3周后,4%多聚甲醛灌注固定大鼠,断头取脑,常规制作石蜡切片,免疫组织化学法检测各组大鼠海马P-gp的表达,具体操作严格参照试剂盒说明书进行。采用Immage-Pro Plus5.0软件,每张切片随机取6个视野,根据切片中阳性面积率,即视野阳性细胞面积/视野总面积(Object/Total,O/T)进行半定量分析。

1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件处理数据,计量资料以(x±s)表示,F检验,各组间比较采用SNK-q检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.3 海马P-gp免疫组化检测结果 光镜下正常大鼠脑组织细胞形态完整,细胞核呈均一蓝色。P-gp阳性细胞黄染,主要位于细胞膜和细胞质;神经元、胶质细胞及血管内皮细胞均可见阳性表达。神经元阳性染色显示胞体呈圆形,带有一条长突起;胶质细胞阳性染色显示胞体形状多样,可以为三角形、椭圆形或不规则形,见图1A-E。NS组大鼠海马内有少量细胞表达P-gp,O/T值为(2.53±0.31)%;与NS组比较,其它4组P-gp表达均增强(P＜0.05);PILO组O/T值为(8.60±0.50)%,CBZ组O/T值为(9.16±0.58)%,2组间无明显差异;LDV组O/T值为(5.15±0.33)%,低于 PILO组及CBZ组(P＜0.05);HDV 组O/T值为(4.94±0.35)%,低于PILO组及CBZ组(P＜0.05);LDV组与HDV组间无明显差异。

图1 A-E NS组(A)、PILO组(B)、CBZ组(C)、LDV组(D)和HDV组(E)大鼠海马P-gp免疫组化染色结果(×400)

3 讨论

P-gp是MDR1的主要表达产物,研究认为RE患者及实验动物脑组织中P-gp的过量表达,是导致脑组织中 AEDs浓度下降,引起耐药的重要原因[6,7]。目前针对P-gp过量表达引起的耐药已研制出多种P-gp抑制剂。维拉帕米是钙通道阻断剂,主要用于治疗心律失常;它也是一种耐药蛋白抑制剂,是P-gp底物转运部位的竞争性配体,可被P-gp泵到细胞外,减少P-gp对化疗药物的外排[8]。研究显示,维拉帕米可升高癫大鼠脑细胞外液中AEDs的浓度[9,10],增加RE患者复杂部分癫发作的时间间隔,改善癫控制效果[11,12]。

本实验结果显示,在CBZ治疗基础上添加维拉帕米,可明显降低自发性癫大鼠性发作频率,减少海马区P-gp表达。推测维拉帕米对RE的治疗作用机制可能有:①通过与P-gp竞争性结合,减少P-gp对CBZ的外排,提高脑内细胞外液CBZ浓度,增强其抗癫作用;②降低RE大鼠脑内P-gp的含量;③作为钙离子拮抗剂,抑制钙离子内流,维持细胞内钙稳定,减少性发作频率;④降低细胞内游离钙浓度,抑制蛋白激酶C活性,调节P-gp功能[13]。本实验维拉帕米2个剂量组疗效无明显差别,可能与所设剂量组偏少及药剂量偏小有关。综上所述,本模型可作为RE耐药模型用于P-gp的相关研究及抗耐药癫药物的筛选;维拉帕米可降低P-gp表达,缓解RE的耐药现象,为RE治疗提供新方向。

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Ef fects of Verapam il on Refractory Epilepsy and on Exp ression of P-glycop rotein in the H ippocampus in Rat Model

LIN Juan-xia▲,CHEN Li-qiang,SUN Mei-zhen,W ANG M ing-zheng.▲Departmentof Neurolog y,The First Hosp ital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

Ob jective:To investigate the therapeutic effect of verapam ilon refractory epilepsy and theeffectof vrerapm il on expression of P-glycop rotein(P-gp)in the hippocampus in ratmode lof refractory epilepsy.M ethod:A ratmodelof spontaneous recurrent seizures(SRS)has been generated through lithium-pilocarpine lumbar injection.The SRS rats with drug resistance were selected and random ly divided into the control,the pilocarpine,the carbamazepine,the low-dose verapam il and the high-dose verapam il group.The frequency of SRS and theexpression of P-gp in hippocampus of rats have been documented.Resu lts:The frequency of SRS and the expression of P-gp in hippocampus in the control group were significantly lower than that in the other four groups(P＜0.05).The frequency of SRSand theexpression of P-gp in hippocampus in both the low-dose and the high-dose verapamilgroupsw ere significantly lower than those in the carbamazepine and the pilocarpine groups(P＜0.05).There w as no differences betw een the carbamazepine group and the pilocarpine group and no difference betw een the low-dose and the highdose verapamilgroup either.Conclusion:Treatment of verapamilmay significantly decrease the frequency of SRS and lower the expression of P-gp in hippocam pus in SRS rats with drug resistance.

refractory epilepsy;verapam il;P-glycoprotein

R741;R741.05

A

1001-117X(2010)01-0021-03

10.3870/sjsscj.2010.01.007

2009-07-06

#【通讯作者】孙美珍,Tel:86-351-4639667,E-mail:meizhensun23@yahoo.com。