大鼠局灶性脑缺血后星形胶质细胞Cyclin D1及Cyclin E的表达*

席青松,朱丽霞,王萍,王晶,陈华先,王芳,张琼,王伟#

华中科技大学同济医学院附属同济医院a.肿瘤科,b.妇产科,c.神经科,武汉 430030

大鼠局灶性脑缺血后星形胶质细胞Cyclin D1及Cyclin E的表达*

席青松a,朱丽霞b,c,王萍c,王晶c,陈华先c,王芳c,张琼c,王伟c#

华中科技大学同济医学院附属同济医院a.肿瘤科,b.妇产科,c.神经科,武汉 430030

目的:研究大鼠局灶性脑缺血后星形胶质细胞细胞周期蛋白Cyclin D1及Cyclin E的表达差异及变化。方法:建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,双光源流式细胞术检测假手术组及缺血再灌注后1 d、3 d、7 d、15 d组大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cyclin D1及Cyclin E的表达。结果:假手术组大鼠星形胶质细胞表达Cyclin D1及Cyclin E,Cyclin E的表达高于 Cyclin D1(P＜0.05);局灶性脑缺血后,星形胶质细胞Cyclin D1的表达逐渐增加,7 d及15 d时高于假手术组(P＜0.05);局灶性脑缺血后,星形胶质细胞Cyclin E的表达无明显变化,各组间比较差异无统计学意义。结论:局灶性脑缺血后星形胶质细胞Cyclin D1表达增强,提示Cyclin D1可能参与脑缺血后星形胶质细胞的活化增殖。

Cyclin D1;Cyclin E;脑缺血;流式细胞术;星形胶质细胞

细胞周期是细胞生命活动的基本过程,细胞在其周期时相的演化过程中经历增殖、分化、衰老和死亡等生理现象,越来越多的证据表明缺血性脑损伤后存在细胞周期的异常激活[1,2]。星形胶质细胞是脑组织中存在的数量最多的细胞,属可增殖细胞,缺血、损伤等刺激可激活星形胶质细胞进入快速增殖。本研究利用双光源流式细胞技术观察局灶性脑缺血后大鼠星形胶质细胞细胞周期蛋白(Cyclin)D1、E的表达,为特定细胞细胞周期调控的进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:成年雄性SD大鼠25只,体质量200～220 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。②主要试剂与材料:胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)小鼠单克隆抗体、Cyclin D1及Cyclin E兔多克隆抗体(购于NeoMarkers公司);异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG(购于Pierce公司);R-藻红蛋白(RPE)标记的羊抗兔IgG抗体(购于Proteintech Group Inc公司);其它化学试剂均为国产分析纯试剂;FACSort型流式细胞仪(购于Becton Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 局灶性脑缺血再灌注模型制备 25只SD大鼠随机分为(缺血再灌注后)1 d、3 d、7 d、15 d组和假手术组,每组各5只。线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(midd le cerebral artery occlusion,MCAO)模型[3]。6%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后仰卧位固定于手术台,常规消毒,颈部正中切开,分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,结扎并游离颈外动脉主干一段,沿颈内动脉向下分离翼颚动脉,在颈总动脉近颈内、外动脉分叉处剪一小口,将涂以硅胶的4-0丝线(长30mm)插入颈内动脉,深度为距颈总动脉分叉处18～20 mm,栓塞右侧大脑中动脉,90min后拔出丝线,缝合皮肤,术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃;假手术组不插入线栓。苏醒后出现右前肢屈曲及前进时向右侧转圈者,为造模成功大鼠。

1.2.2 双光源流式细胞术(flow cy tometry,FCM)检测星形胶质细胞Cyclin D1及Cyclin E的表达

假手术组术后1 d取脑,其它各组分别于术后1 d、3 d、7 d、15 d取脑。深度麻醉大鼠,冰上快速剥离大脑,取缺血侧梗死边缘区皮质,机械法制成单细胞悬液,200目筛网过滤,PBS洗涤、离心2次,5×106/管分装,加入75%冷乙醇固定细胞过夜;PBS洗涤、离心 2次,含 0.25%TritonX-100的 PBS冰上预处理5 min,离心,弃 TritonX-100后加PBS洗涤2次,离心,分别加入GFAP抗体(1∶300)和Cyclin D1抗体(1∶100)及GFAP抗体(1∶300)和Cyclin E抗体(1∶100),4℃孵育过夜;PBS洗涤、离心3次,加入FITC标记的羊抗小鼠IgG(1∶100)和R-PE标记的羊抗兔IgG抗体(1∶100),室温避光孵育60min,PBS洗涤3次,流式细胞仪检测。检测时设阴性对照(以2%BSA代替一抗),激发波长488 nm。Cellquest软件分别对所测GFAP阳性表达细胞Cyclin D1及Cyclin E的表达率进行双参数检测,计算阳性细胞百分率。

1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件处理数据,计量资料以(x±s)表示,F检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

FCM检测结果显示,假手术组大鼠大脑皮质星形胶质细胞表达Cyclin D1及Cyclin E,且Cyclin E的表达高于Cyclin D1(P＜0.05);局灶性脑缺血后随时间增加,星形胶质细胞Cyclin D1的表达逐渐增加,7 d及15 d时高于假手术组(P＜0.05);局灶性脑缺血后,星形胶质细胞Cyclin E的表达无明显变化,各组间比较差异无统计学意义,见图1A-E及表1。

3 讨论

中枢神经系统中存在大量星形胶质细胞,为神经元提供代谢和营养支持,在保护神经元存活、调节突触功能及神经再生和修复中起重要作用[4,5]。研究表明脑缺血损伤导致星形胶质细胞大量增殖,最终形成胶质瘢痕,阻碍神经修复和轴突再生[6]。控制脑缺血后异常激活的星形胶质细胞的细胞周期,减少胶质疤痕形成,促进神经轴突再生,是脑缺血后神经功能恢复研究的热点。

图1 A-E 各组星形胶质细胞Cyclin D1及Cyclin E FMC检测散点图 A:假手术组;B:1 d组;C:3 d组;D:7 d组;E:15 d组;散点图横线以上代表Cyclin D1、Cyclin E阳性细胞群,横线以下代表Cyclin D1、Cyclin E阴性细胞群

表1 各组星形胶质细胞Cyclin D1及Cyclin E阳性细胞百分率比较(x-±s,%)

细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程,分为G1、S、G2及 M 期。细胞周期调控受多种生化因素相互影响,其核心机制是Cyclin的时相性起伏及细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase,CDK)的序列激活[7]。Cyclin/CDK的作用具有时相特异性和细胞特异性,在不同神经细胞类型及细胞周期的不同阶段,起关键作用的Cyclin/CDK分子不同[8,9]。若能找出调控星形胶质细胞增殖的特定蛋白,并对其定向干预,将有助于抑制胶质疤痕形成,促进轴突再生。

细胞周期启动的主要调控点在G1期,是细胞唯一能接受外界增殖或抑制信号的时期。Gl期主要的细胞周期调控蛋白为Cyclin D 1和Cyclin E,分别与其相应的CDK结合形成Cyclin-CDK复合物(CyclinDl-CDK 4/6,Cyclin E-CDK 2),是G1/S 期转化的关键时期[10]。本实验发现局灶性脑缺血后星形胶质细胞Cyclin D1的表达逐渐增加,7 d及15 d时高于假手术组,Cyclin E的表达无明显变化,推测在星形胶质细胞增殖、细胞周期由G1期向S期过渡的转变中,Cyclin D 1发挥更为重要的作用,控制星形胶质细胞细胞周期进程,促进星形胶质细胞的增生。已有实验证实,Cyclin D1基因敲除对星形胶质细胞的增殖有明显抑制作用[11]。Cyclin E在星形胶质细胞中的表达强于Cyclin D1,其原因及作用还需要进一步研究。

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Exp ressions of Cyclin D1 and Cyclin E in Astrocytes of Rats after Focal Cerebral Ischem ia

X IQing-song▲,ZHU Lixia,WANG Ping,WANG Jing,CHEN Hua-xian,W ANG Fang,ZHANGQiong,WANGWei.▲Department of Oncology,Tong ji Hospital,Tong ji Medica l College,H uazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To investigate the change of the expression of Cyclin D1 and Cyclin E in astrocy tes of rats after focal cerebral ischem ia.Methods:Ischem ia w as induced by temporary m idd le cerebral artery occlusion(MCAO).The rats su ffered from MCAO were sacrificed on days 1,3,7 or 15 after reperfusion and rats in control group w ere sacrificed on day 1 after surgical operation.The brain w as taken and the expressions of Cyclin D1 and Cyclin E in astrocy tes were detected by flow cy tometry.Resu lts:The exp ressions of Cyclin D1 and Cyclin E were detected in astrocy tes of the controls and the exp ression of Cyclin E w as higher than that of Cyclin D1(P＜0.05).After focal cerebral ischem ia,the expression of Cyclin D1 in astrocytesw as significantly increased on the edge of ischemic core at7 and 15 days after reperfusion(P＜0.05),while the exp ression of Cyclin E had no significant variation.Conclusion:Cyclin D1 may take part in the p rogression of the cell cycle in G1/S transition in p roliferating astrocytes.

Cyclin D 1;Cyclin E;cerebral ischemia;flow cytometry;astrocy tes

R741;R741.02

A

1001-117X(2010)01-0014-03

10.3870/sjsscj.2010.01.005

国家杰出青年基金(No.30725019)

2009-11-19

#【通讯作者】王伟,Tel:86-27-83663657,E-mail:wwang_tjh@yahoo.com.cn。