淫羊藿总黄酮的分离纯化工艺研究

薛东升，王国明

（上海凯宝药业股份有限公司，上海 201418）

淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿的地上干燥部分，具有补肾壮阳、祛风湿、强筋骨等功效，用于治疗高血压、冠心病、骨质疏松、更年期综合征、阳痿、半身不遂、四肢麻木等。药理研究表明，淫羊藿能增加冠脉血流量，促进实验动物的细胞免疫和体液免疫功能，促进DNA合成率，影响核酸代谢，促进蛋白质合成和骨胳生长，提高心脑血管活性；其主要有效成分是淫羊藿总黄酮，以淫羊藿苷为主[1－2]。对于淫羊藿总黄酮的提取分离工艺研究，文献多有报道[3－5]，但对不同分离、纯化工艺的比较研究鲜有报道。笔者对AB－8大孔吸附树脂吸附、乙酸乙酯萃取和酸碱沉淀3种分离纯化方法进行了比较研究，现报道如下。

1 仪器与试药

岛津LC－10A型高效液相色谱仪，SPD－10AVP紫外可见检测器，EastChrom G02色谱工作站；Cary50型紫外可见分光光度计（美国瓦里安）；AG135型十万分之一电子天平（Mettlet Toledo）。淫羊藿药材（经鉴定为巫山淫羊藿 Epimedium wushanense T.S.Ying，购自上海康桥中药饮片有限公司）；淫羊藿苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为0737－200111，供含量测定用）；AB－8大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；乙腈、甲醇为色谱纯（美国Fisher），水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿提取液制备

取淫羊藿9 kg，依次加10倍量、8倍量水煎煮2次，每次1h，滤过，合并两次煎液，减压浓缩至9 000mL，放凉，加乙醇使含醇量达70％，静置，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至9 000mL，高速离心，取上清液，平均分为9份。

2.2 分离纯化工艺

2.2.1 AB－8大孔吸附树脂吸附法

取提取液3份，分别调pH至5.0，通过已处理好的AB－8大孔吸附树脂柱（6 cm×50 cm），上样速度为1 BV/h，以水洗至流出液无色，弃去水洗液，再以70％乙醇洗脱，洗脱速度为2.5 BV/h，收集70％乙醇洗脱液5 000mL，减压回收乙醇，浓缩，真空干燥，得干膏，称重，计算干膏得率。检测干膏中总黄酮和淫羊藿苷的含量。

2.2.2 乙酸乙酯萃取法

取提取液3份，分别用3倍量的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，浓缩，真空干燥，得干膏，称重，计算干膏得率。检测干膏中总黄酮和淫羊藿苷的含量。

2.2.3 酸碱沉淀法

取提取液3份，分别浓缩至稠膏（d=1.15，60℃），用 5％ NaOH溶液调pH至8.5，60℃保温1h，趁热滤过，滤液加盐酸调pH至2.0，放冷，过滤，取析出的沉淀真空干燥，得干膏，称重，计算干膏得率。检测干膏中总黄酮和淫羊藿苷的含量。

2.3 淫羊藿总黄酮含量测定

2.3.1 溶液制备

精密称取干燥至恒重的淫羊藿苷对照品，用甲醇溶解，制成1 g/L的对照品溶液。精密称取干燥至恒重的提取物0.15 g，用甲醇溶于100mL量瓶中，超声15min，放置冷却，定容；精密吸取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至该度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3.2 最大吸收波长确定

分别精密量取对照品和供试品溶液1mL，各置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用紫外可见分光光度计于200～400 nm波长范围内扫描，得紫外吸收光谱。结果表明，供试品最大吸收波长为270 nm，与淫羊藿苷对照品完全一致，故采用270 nm作为测定波长。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL，置100mL量瓶中，加甲醇定容至100mL，摇匀，照分光光度法，以甲醇为空白，在270 nm波长处测定吸光度。以吸光度（X）对质量浓度（Y）作标准曲线，得回归方程 Y=22.374X+0.086 7，r=0.999 4（n=5）。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在5～25μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密量取对照品溶液1mL，共6份，按线性关系考察项下方法操作，测定吸光度。结果的 RSD=1.02％（n=6）。

稳定性试验：精密量取供试品溶液1mL，按线性关系考察项下方法操作，于制备样品后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h时测定吸光度。结果的 RSD=0.38％（n=6），表明供试品溶液在3h内稳定。

重复性试验：取同一样品6份，按样品含量测定项下方法操作。结果的 RSD=1.73％（n=6），表明方法重现性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品（79.43％）75mg，共6份，分别用甲醇溶于100mL量瓶中，超声15min，定容；精密吸取1 mL，置100 mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液（0.108 g/L）4，6，8mL，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，按线性关系考察项下方法测定。结果见表1。

表1 淫羊藿总黄酮加样回收试验结果（n=6）

2.3.4 样品含量测定

精密称取提取物，依法制备供试品溶液，精密量取1mL，同线性关系考察项下方法测定吸光度，按回归方程计算含量。

2.4 淫羊藿苷含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈－水（30∶70）；流速：1mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。理论板数以淫羊藿苷计算应不低于2 500。

2.4.2 溶液制备

精密称取干燥至恒重的淫羊藿苷对照品，用甲醇配制成质量浓度为0.108 g/L的溶液，作为对照品溶液。取提取物25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理10min，放冷，再加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.3 方法学考察

系统适用性试验：取供试品及对照品溶液适量，按拟订的色谱条件测定。结果供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱有相同保留时间的色谱峰（图1）。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取淫羊藿苷对照品4mg，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，使每1mL含淫羊藿苷0.16mg。分别精密量取以上对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，依次进样10μL，以淫羊藿苷进样量（X）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=4 762.5X+108.1，r=0.999 9（n=5）。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在32～160μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取0.108 g/L的淫羊藿苷对照品溶液10μL连续进样6次。结果峰面积的 RSD=0.76％（n=6）。

稳定性试验：吸取供试品溶液，于1，2，4，8，12，24h时依法测定。结果的 RSD=2.02％（n=6），表明24h内供试品溶液基本稳定。

重复性试验：取同一批样品，依法制备供试品溶液，分别进样测定。结果含量的 RSD=1.26％（n=6），表明方法重现性较好。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品（46.58％）12.5mg，共6份，分别用甲醇溶于10mL量瓶中，超声10min，定容；精密吸取1mL，置10mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液（0.108 g/L）4，6，8mL，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，依法测定含量。结果见表2。

表2 淫羊藿苷加样回收试验结果（n=6）

2.4.4 样品含量测定

精密称取提取物样品25mg，依法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液（0.108 g/L）和供试品溶液各10μL，进样测定，计算淫羊藿苷的含量。

2.5 3种方法比较

计算不同分离纯化方法所得到的干膏得率、总黄酮的含量和淫羊藿苷的含量。结果见表3。

表3 3种方法所得干膏得率、总黄酮含量和淫羊藿苷含量（±s，％）

表3 3种方法所得干膏得率、总黄酮含量和淫羊藿苷含量（±s，％）

分离纯化方法AB－8大孔吸附树脂吸附法乙酸乙酯萃取法酸碱沉淀法干膏得率5.23±0.21 3.83±0.14 4.16±0.20总黄酮含量80.35±2.80 58.41±3.04 63.38±2.20淫羊藿苷含量46.24±1.12 28.15±1.38 32.77±0.97

3 讨论

考察结果表明，以AB－8大孔吸附树脂吸附法最理想，其次为酸碱沉淀法，而乙酸乙酯萃取法较差。本研究中淫羊藿最佳分离纯化工艺运用了大孔吸附树脂吸附法，显著提高了提取物中总黄酮和淫羊藿苷的含量，对改进中药分离纯化工艺有一定意义。同时，该工艺稳定性好，操作简便，适合于工业化生产。

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