银屑病皮损中VEGF、bFGF的表达及与微血管密度的相关性研究

2010-04-04杨海龙栗玉珍

实用皮肤病学杂志 2010年2期

杨海龙，栗玉珍，党林

· 论著 ·

杨海龙，栗玉珍，党林

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在银屑病患者皮损血管生成机制中的作用。方法采用免疫组化法检测寻常型银屑病患者皮损处VEGF、bFGF及微血管密度（MVD）的表达情况，并与正常皮肤进行比较分析。结果寻常型银屑病患者皮损处VEGF、bFGF的表达及MVD值明显高于正常对照组（P＜0.05），VEGF与bFGF在银屑病患者皮损中的表达差异有显著相关性（P＜0.05）。结论VEGF及bFGF可能引起银屑病患者皮损处血管增生，VEGF与bFGF在银屑病微血管增生过程中发挥正性调节作用且具有协同促进性。

银屑病；血管生成；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；微血管密度

[J Pract Dermatol, 2010, 3(2):65-68]

银屑病皮损处最先发生的病理改变是血管的分布和形成异常[1]，作为一种与血管生成相关的疾病，对银屑病的血管生成机制的研究现已成热点，特别是一些血管生成相关因子日益受到重视。而对于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）二者在银屑病发病中的共同作用机制，目前却少有进一步的实验研究。本实验以寻常型进行期银屑病患者及正常人皮肤为研究对象，采用免疫组化方法，观察其皮损处VEGF及bFGF的表达情况，并对二者与银屑病皮损处的微血管异常增生的关系进行比较分析，探讨VEGF及bFGF在银屑病皮损处的微血管异常中发挥作用的情况。

1 材料与方法

1.1 研究对象

寻常型进行期银屑病患者28例，来自哈尔滨医科大学附属二院皮肤科，其中男15例，女13例；年龄范围15～65岁，平均42.1岁；病程6个月～20年，平均4.2年；皮损面积6%～40%。符合以下标准：①两周内未使用糖皮质激素、维A酸类药物局部治疗者；②八周内未系统使用糖皮质激素、免疫抑制剂者；③无其他系统性疾病及免疫功能缺陷者。活检取材0.6cm×1.0cm大小皮损，躯干15例，上肢5例，下肢8例。

15例对照组正常人皮肤来自哈医大二院整形美容科门诊手术室，其中游离植皮修复术6例（腹部4例，下肢2例），下睑松弛整形术4例，面部除皱术5例，入选者均排除全身系统性疾病。

所有标本经固定、包埋后，3μm切片，取一张做苏木素-伊红染色，备普通病理用。

1.2 主要试剂

抗VEGF抗体（兔抗人单克隆抗体，工作液），抗CD34抗体（鼠抗人单克隆抗体，工作液），免疫组化通用型两步法检测试剂盒PV6000，均购自北京中杉生物技术有限公司，抗bFGF抗体（兔抗人多克隆抗体，1: 200）购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 实验方法

免疫组化两步法（PicTure™）按试剂盒操作说明进行，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

VEGF和bFGF 细胞有棕黄色颗粒视为染色阳性。采用半定量计分法判定[2]。按着色程度评分，无着色=0，浅黄色=1，棕黄色=2，棕褐色=3。按阳性细胞所占比例评分，＜20%=0，20%～50%=1，50%～80%=2，＞80%=3。按以上2项指标的积分和分为4级，（-）为0～1分，（+）为2分，（++）为3～4分，（+++）为5～6分。

CD34与MVD计数 CD34定位于血管内皮细胞，阳性者被染成棕色。MVD的测定参考Weidner等[3]方法进行，即先在低倍镜（100×）下扫视整片，寻找高密度血管区，确定微血管最密集的3个视野，然后在高倍镜（400×）下计数每一个视野下的微血管数目。取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管密度值。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS15.0/PC软件进行统计分析，VEGF、bFGF结果采用等级资料比较的秩和检验，CD34采用小样本t 检验，VEGF、bFGF及CD34间表达相关性分析采用Spearman等级相关及Kendall等级相关分析，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF的表达

VEGF在银屑病患者皮损中主要表达于角质形成细胞胞浆，为细胞内颗粒状棕黄色染色，VEGF表达几乎遍布表皮全层，但以棘层染色最强，基底层细胞染色明显减弱或不染色，真皮浅层浸润的部分炎症细胞胞浆内亦可见到阳性表达。血管内皮细胞可见少量表达（图1）。在正常人皮肤中VEGF亦有表达，但表达弱，表皮层以基底层及棘层细胞为主（图2），结果显示，VEGF在银屑病中的表达高于正常对照组，差异有统计学意义（u =28，P＜0.01）。

2.2 bFGF的表达

bFGF在银屑病患者皮损中主要表达于角质形成细胞浆，定位于表皮基底层和棘层下部，为棕黄色或黄色，真皮少量表达于真皮浅层的血管，位于血管壁和血管周围，为黄色或淡黄色。毛囊、成纤维细胞和淋巴细胞亦有不规则表达（图3）。正常人皮肤中bFGF表达于表皮的基底层，黄色或淡黄色，真皮表达位置与银屑病组一致，呈弱表达（图4），bFGF在银屑病中的表达高于正常对照组，差异有统计学意义（u=103，P＜0.01）。

2.3 CD34的表达

CD34 阳性染色表达位于血管内皮细胞的胞浆，形成条状或环状，呈弥漫分布，在正常对照组及银屑病患者的皮损真皮层血管内皮细胞均有CD34 表达（图5，6），银屑病患者MVD 计数（22.02±5.57）显著高于正常对照组MVD计数（4.62±2.28），差异有统计学意（t =14.420，P＜0.01）。

2.4 相关性分析

VEGF与bFGF在银屑病患者皮损中的表达差异有相关性（r =0.4，P＜0.05）（表1），VEGF与MVD差异有相关性（r =0.346，P＜0.05）， bFGF与MVD差异有显著相关性（r = 0.434，P＜0.01）（表2）。

表1 银屑病皮损VEGF与bFGF的相关性分析

表2 银屑病皮损VEGF、bFGF的表达与MVD的相关性

3 讨论

VEGF是一种作用最强，且唯一能特异性作用于内皮细胞的有丝分裂原，它不仅可以促进真皮血管内皮细胞分裂增生，还可以增加血管通透性，并对炎症细胞、内皮细胞有化学趋化作用。笔者的实验表明，银屑病皮损处VEGF表达明显增加，这与Detmar等[4]报道相一致。在正常人皮肤中也有一定量的VEGF表达，主要分布于表皮基底层和毛囊外毛根鞘部位，此处的VEGF可能以旁分泌作用调节皮肤血管的自身平衡[4]。最近有报道[5]将编码VEGF的基因转入小鼠皮肤可致银屑病样改变，包括特征性血管变化、表皮变化和炎性细胞浸润，这进一步表明VEGF 可能在银屑病发病过程中起重要作用。

图1 银屑病皮损处VEGF的表达

图2 正常皮肤VEGF的表达

图3 银屑病皮损处bFGF的表达

图4 正常皮肤bFGF的表达

图5 银屑病皮损处CD34的表达

体外培养表明正常皮肤中主要是角质形成细胞分泌VEGF，而银屑病的角质形成细胞和成纤维细胞均可分泌大量的VEGF。有报道，由角质形成细胞分泌的VEGF对于银屑病皮损部血管异常起着决定作用，可加重银屑病皮损处的炎症反应，促进银屑病的病理过程，且进行期皮损的真皮乳头层微血管内皮细胞上可见有VEGF受体KDR和FLT-1 的表达，而正常皮肤则无[6,7]。

bFGF是一种能促进细胞增殖和血管生成的多功能细胞因子，现已证明其在体内外对内皮细胞有促分裂和趋化作用，能刺激内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白酶，降解基底膜，并诱导毛细血管内皮细胞向三维胶原基质中迁移，形成毛细血管样腔状结构[8,9]。

在多种肿瘤细胞中，bFGF常呈过度表达, 参与促进瘤细胞增殖和血管生成的病理过程[10]。在表皮肿瘤、脂溢性角化病、基底细胞上皮瘤和鳞状细胞癌等中均可见bFGF蛋白的表达。本实验中，bFGF在银屑病表皮中阳性表达程度显著高于正常人皮肤表皮层，基底层最明显，这一研究结果与Arbiser等[11]用免疫组化法检测bFGF在银屑病表皮的表达定位基本一致。基底层是正常人皮肤组织中增殖和代谢最活跃的部位，bFGF在此部位的高表达表明其可能对角质形成细胞的增殖、分化起一定作用。bFGF不仅高表达于银屑病皮损表皮，亦少量表达于真皮异常增生的微血管，提示bFGF高表达在银屑病中的作用可能与它们在肿瘤与新生血管中的作用一样,都促进了血管增生。

Bequet-Romero等[12]在试验中发现bFGF对VEGF的表达具有调控作用，而本研究中，银屑病皮损处二者表达相关性也提示bFGF可能是通过上调VEGF及其受体的表达而间接促进了血管生成，这说明VEGF与bFGF在银屑病中促血管生成方面能起一定的协同作用。但VEGF与bFGF在银屑病中促血管生成方面发挥协同作用的具体调控机制及与其它血管生成相关因子间的相互作用还有待于进一步深入研究探讨。

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Study on correlation between expression of VEGF, bFGF and MVD in the psoriatic lesions

YANG Hai-long，LI Yu-zhen，DANG Lin
Department of Dermatology, The Fifth Affliated Hospital of Harbin University, Daqing 163316, China

ObjectiveTo investigate the effect of VEGF and bFGF in the mechanism of the angiogenesis of psoriasis vulgaris.MethodsThe expression of VEGF, bFGF and MVD from samples of psoriasis vulgaris tissue was examined by immunohistochemistry. Then, compared with those of skin tissue from healthy individuals.ResultsThe expression of VEGF, bFGF and MVD in psoriasis vulgaris tissue was significantly higher than those in the normal group (P＜0.05). There was a significant correlation between the expression of VEGF and that of bFGF (P＜0.05).ConclusionVEGF and bFGF possibly may cause angiogenesis in psoriatic lesion. VEGF and bFGF play positive role in regulating and facilitating synergy in the process of proliferation of microvessels in psoriasis.

Psoriasis；Angiogenesis；Vascular endothelial growth factor；Basic fibroblast growth factor；Microvessel density

R758.63

1674-1293(2010)02-0065-04