苦瓜花药培养研究进展

唐懿，李万宁，刘继，郑阳霞，李焕秀

（1.四川农业大学园艺学院，四川雅安，625014；2.四川双流县农村发展局）

苦瓜花药培养研究进展

唐懿1，李万宁2，刘继1，郑阳霞1，李焕秀1

（1.四川农业大学园艺学院，四川雅安，625014；2.四川双流县农村发展局）

针对 影响苦瓜花药培养的主要因素，如基因型、小孢子发育时期、生长环境、预处理、培养基、碳源、激素、添加物等进行综述，讨论了目前苦瓜花药培养中存在的问题，并为以后苦瓜花药培养提供了研究方向。

苦瓜；花药培养；研究进展

苦瓜（Momordica charantiaL.）又名凉瓜，为葫芦科苦瓜属一年生蔓生植物，已有数百年的食药两用史，其营养丰富，抗坏血酸含量在瓜类蔬菜中最为突出，且性味苦寒，具有清心涤热、明目解毒之功效，以及降血糖、抗菌、抗病毒等多重作用[1]，在广大消费者中颇受欢迎[2]。苦瓜在过去多为南方人喜爱，现也渐为北方人所接受，成为一种时尚蔬菜。利用保护地和露地栽培相结合，基本可保证四季供应，不仅能满足人们的消费需要，也可使生产者获得较高的经济效益[3]。

单倍体育种是从植物细胞培养中派生出的一种新育种技术，主要是利用植物的花药诱导出单倍体植株，其优点是获得的纯合二倍体后代性状整齐一致，没有普通杂交后代性状参差不齐的分离现象，可免去漫长的多代选育鉴定过程，另外在杂合二倍体中表达不出的隐性基因均可在单倍体植株中表达，从而有利于发现植物的优良性状，提高育种效率。利用花药培养诱导单倍体具有十分重要的理论意义和应用价值。目前在大多数的瓜类蔬菜中已开展了这方面研究，但是成功的例子不多，而关于苦瓜的花药离体培养方面的研究较少。

1 苦瓜离体培养研究概况

有关苦瓜的离体培养国内外报道不多，现有的研究均处于初级阶段。主要是利用苦瓜的无菌苗，取其子叶、真叶、下胚轴、茎尖和带芽茎段等进行组织培养，但效果均不理想。苟小平等[4]用苦瓜无菌苗幼叶分离的原生质体，培养出了小愈伤组织，但未见有进一步分化的报道。申洪业[5]对苦瓜的下胚轴进行离体培养，只得到了愈伤组织。Islam等[6]进行了苦瓜子叶离体培养研究，不定芽的再生频率很低。王小荣等[7]利用苦瓜的子叶、真叶、下胚轴进行试验，只在子叶上得到了不定芽，且诱导率不高。李靖[8]用苦瓜无菌苗的子叶诱导不定芽，诱导率也不高。唐琳等[9，10]利用无菌种子苗茎尖和带芽茎段得到了增殖芽，但效果不理想。

2 瓜类花药组织培养研究概况

西贞夫对黄瓜花药培养进行了研究，诱导出愈伤组织并分化出茎叶器官，开创了瓜类花药培养的历史先河[11]。陈伟等[12]分别对甜瓜花药培养进行了研究，经愈伤组织分化成苗；陶正南[13]对甜瓜花药进行培养，经愈伤组织诱导获得了完整的再生植株，但无有关再生植株倍性方面的报道。Sinha对普通丝瓜进行花药培养，诱导出愈伤组织。在西瓜的花药培养中，薛光荣等[14]对2个西瓜品种的花药进行了愈伤组织诱导，获得了花粉植株。Ashock Kumar等[15]使用2个黄瓜品种通过B5诱导和分化培养基进行花药培养获得花粉再生植株。陈佳[16]对长白苦瓜进行了愈伤组织诱导，但只得到不定根。瓜类花药培养难度较大，诱导率太低，难以应用于育种实践。

3 花药培养的影响因素

3.1 基因型

花药对离体培养的反应在很大程度上受到基因型的影响，不同基因型的植株对培养的反应不同[17]。在瓜类蔬菜中，不同的种属有不同的表现。黄瓜早在1971年就通过花药培养获得了不定芽[18]，哈密瓜、白兰瓜（兰州蜜瓜）、丝瓜、西瓜、甜瓜在此方面都有不同程度的研究，以西瓜花药培养技术的研究最为成熟。在相同种属的不同品种间，花药培养也有不同的表现。谢淼等[19]的研究表明，取同一时期不同品种的黄瓜花药均可诱导出愈伤组织，但诱导率不一样，质量也不一样。在苦瓜的研究中也证实了这一点[20]。

3.2 小孢子发育时期

根据现今研究资料表明，产生单倍体的效率取决于多个因素，最关键的是取花药时小孢子的发育时期。在黄瓜花药培养中，西贞夫认为不同发育期的花药，均能形成愈伤组织[21]，而谢淼等[19]却认为，单核中后期的花药作为外植体较适合。

何艳等[20]研究发现，单核中晚期的花药愈伤诱导率最高。而甜瓜花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期[22]，可见不同作物花药培养要求的最适小孢子发育时期不同。在实际取材时可以根据花药长度、花蕾大小、外观形状和色泽等与花粉发育进程的相关性有目标的直接采样。

3.3 材料发育时期的生长环境

除小孢子发育时期外，材料发育时期的生长环境对花药培养效果也有较大的影响。不同生长季节、栽培环境、不同部位的花蕾，其花粉的生理状态可能均不同，诱导率也有明显差异。谢淼等[19]发现，春季接种的黄瓜花药表现的诱导效果比秋季的好。在西瓜花药培养中发现，开花前期的花药，愈伤组织诱导频率较高，且具有良好的分化潜力[23]。大白苦瓜的花药培养，最佳取材时期为5～7月的阴天9：00～10：00[17]。

3.4 花药的预处理

瓜类花药培养中常用的预处理方式是4℃低温处理，对于不同的种类、品种和生理状态，要求的预处理时间不同。西瓜的合理处理时间为72 h[24]，甜瓜为36 h[22]，南瓜则为 4 d[25]，黄瓜处理 2 d的效果最佳[26]。4～7℃的低温预处理都可以显著地提高丝瓜愈伤组织的诱导率，且在4～8 d的时间范围内，处理时间越长，愈伤组织诱导率越高[27]。而苦瓜的花药培养研究却发现4℃预处理出现负效应，即愈伤组织诱导率随着预处理时间的延长而逐渐下降，以未经过预处理的花药愈伤组织诱导率最高，预处理天数达4 d时，愈伤组织诱导率大幅下降[28]。

3.5 基本培养基

大多数的瓜类花药培养都用MS作为基本培养基。谢淼等[19]选用了MS和B5对黄瓜花药进行培养，原式琼采用N6的大量元素、MS的微量元素作为分化培养基进行哈密瓜的花药培养，而董艳荣[22]在甜瓜花药培养中则以MS-KI作为培养基，即增加1倍Fe-EDTA、Mg2SO4·7H2O和VB1。此外也有选用N6进行丝瓜离体培养，还有利用不同基本培养基改良后的组合进行瓜类离体培养，而苦瓜花药培养一般以MS作为培养基。

3.6 碳源

所有瓜类花药培养的研究试验中，以蔗糖作为碳源的试验较多，但针对碳源进行比较的试验较少。大多研究发现，蔗糖作为碳源比葡萄糖或麦芽糖更利于苦瓜花药愈伤组织的诱导[17，20]。

3.7 激素

激素的水平和配比通常对诱发细胞的分裂，生长和分化起着决定作用。西贞夫认为在不含生长素的培养基上几乎不会形成愈伤组织。在瓜类花药愈伤组织诱导过程中，BA是一个关键因素。大多数的瓜类花药培养试验表明，在基本培养基中添加BA均能诱导出愈伤组织，配合2，4-D和KT使用效果更好[29]，且BA在愈伤组织分化过程中也起着重要作用。此外，NAA也有利于愈伤组织的诱导，但浓度不宜过高，董艳荣[22]认为最好不超过0.05 mg/L。在黄瓜花药培养中，低浓度的KT，NAA和2，4-D配合可使愈伤组织诱导率达100%[20]。在西瓜的花药培养中，使用高浓度的GA3、BA和腺嘌呤或再添加500 mg/L的水解乳蛋白，可诱导愈伤组织快速分化出植株，若添加三十烷醇或BA可加快分化出正常植株[24，30]。马刘峰等[31]认为，2，4-D在诱导甜瓜花药由愈伤组织形成胚性细胞团的过程中起了重要作用。研究发现，苦瓜花药愈伤组织生根比较容易，这可能是由于苦瓜中内源生长素比较高，但是未见诱导出芽的报道[16，20]。

3.8 培养条件

适宜的温度和光照对愈伤组织的诱导和生长都非常重要[32]。瓜类的花药培养温度比其他种类蔬菜要高一些，一般白天为25～30℃，夜间则稍低[33]。当培养温度为28℃时，黑暗条件下可诱导出具有胚性细胞的甜瓜花药胚性愈伤组织[34]。在苦瓜中还没有针对不同培养条件而进行的比较试验。

3.9 活性炭

活性炭可以吸收培养基及花药本身产生的抑制物质，对一些蔬菜的花药培养是有益的。但有关活性炭对瓜类花药培养的影响报道较少，只有喻财铃[27]研究指出，活性炭对丝瓜花药培养的效果差，有抑制作用。

4 问题及展望

苦瓜的单倍体育种还处于起步阶段，存在很多问题需要解决。第一，尽管愈伤组织诱导率得到了提高，但小植株的诱导没有成功，只获得了少量不定根。第二，有关苦瓜花药培养的研究太少，缺乏系统、全面、深入的研究。

根据苦瓜易形成愈伤组织而不宜分化不定芽的特点，针对花药及其诱导出的愈伤组织中内源激素的含量方面进行研究，分析其规律性，为苦瓜花药培养外源激素的添加提供一定的理论依据。

对于苦瓜花药培养得到的较丰富的愈伤组织材料，可比较其形态结构特征，结合切片观察等技术，及时筛选出有可能成为胚性的愈伤组织类型，有针对地进行诱导。

花粉（小孢子）培养是另外一条获得单倍体的途径，该途径能避免花药壁对单倍体形成的抑制作用，克服嵌合体现象。因此，有必要加强该方面的研究。

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Progress on Anther Culture in Balsam Pear(Momordica charantiaL.)

TANG Yi1,LI Wanning2,LIU Ji1,ZHENG Yangxia1,LI Huanxiu1
(1.College of Horticulture,Sichuan Agricultural University,Sichuan,Ya'an 625014; 2.Countryside development office,Shuangliu,Sichuan)

Anther culture is an important breeding technique in vegetable crops.The factors affecting anther culture of balsam pear,such as genotype,growth phase of microspore,growth environment of material,pretreatment,medium,carbon source,plant growth regulators,medium additions were summarized.The future research direction was put out according to existing problems in balsam pear anther culture.

Balsam pear;Anther culture;Progress

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.24.002

四川农业大学青年科技创新基金（003309）

唐懿（1984-），女，在读博士研究生，研究方向为园艺植物育种与生物技术，E-mail：tangyisunguochao@sina.com

李焕秀，通信作者，E-mail：hxli62@163.com

2010-01-15