一氧化氮与卵母细胞发育*

朱 亮,章孝荣,刘 亚,陶 勇

(安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥 230036)

一氧化氮(nitrtic ox ide,NO)是目前已知的动物细胞中最小的也是最简单的生物活性物质之一,难溶于水,极易溶于脂类,能自由穿过生物膜,快速在细胞间进行扩散,因此NO广泛地参与机体的生理和病理过程。大量研究表明,在循环系统中,NO可以舒张血管平滑肌,从而调节血管张力、增加血管通透性以及降低血压;在神经系统中,NO可以作为神经递质发挥信号传导作用;在免疫系统中,巨噬细胞产生的NO可以起到抑制微生物的作用。另外,近年来的研究还证实,NO在卵泡的发育、排卵或闭锁、受精和胚胎发育等生殖过程中亦起重要作用。为深入了解NO与生殖的关系,本文根据近年的一些研究资料,着重对NO与卵母细胞发育这一问题进行综述。

1 概述

1.1 体内NO的发现

NO原是Hum phrey Davy在研究笑气(N2O)时发现的一种被认为是对生物有机体有害的气体。1977年,人们发现在许多组织中NO能通过激活鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC),促使三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)转化成环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)发挥其生物学作用。在第四届国际血管扩张药物机制研讨会上,Furchgott等提出乙酰胆碱诱发血管扩张依赖于内皮细胞产生的一种不稳定的松弛物质——内皮细胞舒张因子(endothelium derived relaxing factor,EDRF)的存在。同年,Furchgott等同时并相对独立地推断出NO即为EDRF。随后,Palmer等利用化学发光法比较直接地证明内皮细胞可以释放NO,又应用质谱法研究同位素15N标记的L-精氨酸(L-arginine,L-A rg)的标记试验,权威地证实15NO中的15N来源于L-A rg终末胍基上的氮原子,从而证明了L-A rg是合成NO的底物。1998年,美国纽约州立大学的科学家Furchgott、德克萨斯大学医学院的Murad和加利福尼亚大学洛杉矶分校的Ignarro因发现NO在心血管系统中的重要作用而获得该年度诺贝尔生理及医学奖。

1.2 NO的生物学特性

自然界中的NO是由氮气(N2)和氧气(O2)在放电情况下合成的,因拥有一个未配对电子而具有较强的化学反应能力。在生物体内,NO是在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form o f nicontinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH,也称为还原型辅酶Ⅱ)和氧气(O2)存在条件下,由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化L-A rg胍基氮原子氧化生成的。合成后的NO极不稳定,3 s～5 s即被氧化,主要以硝酸根(NO3-)和亚硝酸根(N)的形式存在于细胞内、外液中。

现已确定的NOS有3种亚型,即神经型NOS(neuronal NOS,nNOS,又称Ⅰ型 NOS)、诱导型NOS(inducib le NOS,iNOS,又称Ⅱ型NOS)和内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS,又称Ⅲ型NOS),其中nNOS和eNOS又被称为组成型NOS(constitutive NOS,cNOS)。cNOS为钙(Ca2+)依赖型,催化生成NO的量少,仅在10-12mol/L水平,而iNOS为非Ca2+依赖型,催化生成的NO量较前者多,在10-6m ol/L水平。

1.3 NO的作用途径

研究证明,NO在生物体内发挥多种生物学效应,这是由于它参与调节了多个信号通路,其中最主要的作用途径是NO与可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sCG)中的血红素辅基中的亚铁离子(Fe2+)相结合,改变sCG构象并激活该酶,促使GTP环化成cGM P,导致细胞内cGMP浓度升高,进而激活cGMP依赖性的蛋白激酶G(protein kinase G,PKG),并抑制Ca2+或钙调节蛋白引导的肌球蛋白轻链的磷酸化,从而发挥信号传导的功能。另一条非cGMP依赖途径,通过使一些游离氨基酸、多肽和蛋白质中的巯基S-亚硝基化,改变其蛋白质结构而发挥生物学效应。此外,NO还可以通过激活环氧化酶或蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),或通过P53/Bax途径影响转录因子活性的方式来调节细胞间和细胞内的信号传递。

2 一氧化氮与卵母细胞发育

2.1 NO在卵巢组织中的分布

Lisa等最先采用免疫组化技术证实了在大鼠腔前卵泡、格拉夫氏卵泡、排卵卵泡和黄体化卵泡中均有eNOS和iNOS的表达,尤其是黄体化卵泡中的表达量最高。随后,大量试验研究表明,在鼠[1]、猪[2]、牛[3]等多种哺乳动物卵巢中的卵泡膜细胞、间质细胞、颗粒细胞和从原始卵泡阶段一直到排卵前卵泡阶段的卵母细胞,及黄体和白体上的颗粒实质细胞,均有eNOS和iNOS分布。对卵母细胞发生过程中NOS在卵巢中的分布进行研究,发现eNOS和iNOS在妊娠33日龄到61日龄的胎猪卵巢中上皮细胞、间质细胞、卵原/卵母细胞也有广泛的分布[4],且表达量随着卵母细胞发育呈增强趋势。

大多数研究者认为,哺乳动物卵巢中只存在eNOS和iNOS的表达,但Kim报道称在猪卵巢的上皮细胞、基质、间质细胞、卵母细胞、颗粒细胞和血管内皮细胞上,nNOS同eNOS、iNOS一样存在表达[5],并通过蛋白质印迹分析得出,在具有多层颗粒细胞的次级卵泡和囊状卵泡的颗粒细胞上都具有nNOS和iNOS免疫阳性反应,而具有单层或两层颗粒细胞的腔前卵泡和初级卵泡的颗粒细胞上的则没有,但在任何阶段卵泡的上皮细胞、基质、卵母细胞、膜细胞、GC和血管内皮细胞上eNOS都有阳性反应,且卵巢中eNOS的免疫活性比nNOS和iNOS强。

2.2 NO与卵母细胞发生

卵母细胞的发生是胚胎发育过程中的重要生理事件。哺乳动物卵母细胞的发生一般在胚胎发育早期,此时生殖细胞与体细胞分离,形成原始生殖细胞,再经过性别决定和性分化后,形成卵原细胞或精原细胞,卵原细胞又经细胞分裂分化,最终形成具有受精能力的卵母细胞[6]。

在猪胎儿发育的早期阶段,从妊娠33日龄到61日龄[4],随着卵巢卵原细胞增殖分化,有丝分裂结束,减数分裂开始,初级卵母细胞形成,共质体和合胞体演化形成原始卵泡的发育过程[7],eNOS和iNOS的表达活性逐渐增强,且二者分布、变化趋势和催化产生NO的量并不完全相同,iNOS比eNOS表达持续和强烈,但这两种同工酶在生殖细胞发生、发育过程中存在密切协同关系,共同对胎儿早期卵原细胞增殖调控和卵母细胞生长起着促进的作用。

2.3 NO与卵母细胞成熟

卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质成熟,是指卵母细胞恢复成熟分裂并进一步发育到第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)的过程。有关NO对卵母细胞成熟的影响,A lbina等向小鼠体内注射NOS抑制剂,结果发现小鼠卵母细胞减数分裂发生异常,而且排卵数也有所下降。随后,Jab lonkashariff A等[8]发现敲除小鼠eNOS基因,大量卵母细胞保持在MⅠ期,与正常的小鼠相比,eNOS基因敲除小鼠卵巢重量和排卵率均显著下降。而Huo用iNOS抑制剂氨基胍(aminoguanidine,AG)处理后,发现小鼠卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle break down,GVBD)和第一极体(polar bodyⅠ,PBⅠ)排出过程被阻断[9],表明iNOS也参与了小鼠卵母细胞的成熟。

近年来的研究结果充分证明,在卵母细胞成熟过程中,NO同样表现出双重生物学作用。由iNOS和eNOS产生的一定浓度NO和硝酸盐/亚硝酸盐,能够诱导停滞于MⅠ期卵母细胞减数分裂的重新开始[10],并持续地刺激卵母细胞成熟,促进各时期卵泡发育成囊状卵泡[11]。研究发现,较低浓度(≤10-5mmol/L)的外源性NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对卵丘包裹的卵母细胞和裸卵的减数分裂有促进作用,但对卵丘扩展(cumulus expansion)没有显著影响[12]。Schwarz用另一种NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acety lpenicillamine,SNAP)处理体外成熟(in vitro maturation,IVM)的牛卵母细胞时还发现,10-5mmol/L的SNAP处理的卵母细胞成熟率为55%,但10-7mmol/L的SNAP组的卵母细胞成熟率高达72%[13]。

过量(≥10-3mmol/L)的SNP或SNAP则会显著地抑制卵丘扩展、GVBD和卵母细胞成熟,尤其是由MⅠ期到MⅡ期的过程[12],使大量卵母细胞停止在MⅠ期[11],成熟率仅7%[13],这种影响可能与卵丘细胞相关。M atta研究证明,iNOS抑制剂AG通过降低卵丘卵母细胞复合体(oocyte-cum ulus cell com plexes,COCs)中的卵丘细胞的生存能力和皮质颗粒细胞的迁徙能力,抑制了GVBD后的卵母细胞继续成熟,但这种抑制效应能够被SNP逆转[14]。Tao用AG处理CEOs和Dos后也发现,AG能抑制CEOs减数分裂的重新开始和卵丘扩展,而用iNOS和eNOS非选择抑制剂左旋硝基精氨酸(Nw-Nitro-L-arginine,L-NNA)和左旋硝基精氨酸甲基脂(Nw-Nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)虽抑制CEOs中卵母细胞减数分裂的恢复和卵丘扩展,但对Dos却没有影响[15]。其结果表明,iNOS产生的NO必须通过卵丘细胞间接作用于卵母细胞的减数分裂成熟和卵丘扩展,而eNOS可直接作用于卵母细胞而影响其减数分裂成熟。

2.4 NO与排卵

卵母细胞的发育成熟及排出是一个极其复杂的过程,大部分研究者都认同下丘脑-垂体-卵巢轴的相互作用,即中枢神经内分泌系统是卵泡发育成熟及其排卵的主要调节机制。在正常的排卵周期中,NO作为新型的时空信使发挥着重要的生理学特性。目前大量资料表明,NOS/NO与卵母细胞的排出有关[16]。Shukovski等发现iNOS抑制剂能显著抑制大鼠排卵,并且这种作用可被SNP逆转。Pallares P等[17]通过eNOS基因敲除小鼠与正常小鼠对比还发现,eNOS基因敲除后的小鼠不排卵率明显升高,可见NO的缺少将影响卵泡的正常生长和排卵[1]。因此,NO对排卵有促进作用。而过量的NO也同样抑制排卵,敲除小鼠TK受体后导致NO浓度升高,促使卵巢体积变小和排卵率的下降[18]。高浓度的NO通过cGMP信号通路,抑制促黄体素(luteotrophic hormone,LH)诱导细胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated p rotein kinases,MAPKs)活性,进而干扰阻断间隙连接通路(gap junctional communication,GJC),抑制卵丘细胞扩展,最终抑制成熟卵母细胞的排出[19]。此外,NO还可以通过调节其他生殖激素,如雌激素(estrogens)、促卵泡素(follicle-stim ulating hormone,FSH)和前列腺素(prostaglandin,PG)等的水平来调节排卵,同时还利用其对血管通透性的作用,调节卵泡压,进而调节卵泡的破裂影响排卵。

2.5 NO与卵泡闭锁

卵巢卵泡的发育必须经历卵泡发生、卵泡募集和卵泡选择的过程,最终使少量卵泡发育成优势卵泡并成熟排卵,其他99.9%以上的卵泡会在发育的不同时期发生闭锁。许多研究表明,卵泡细胞凋亡是卵泡闭锁的潜在机制,而NO在细胞凋亡方面的作用具有双重性,即NO既能促进细胞凋亡,又能抑制细胞凋亡的发生。

在卵泡发育过程中,NO主要通过影响GC凋亡来影响卵泡闭锁。目前,为了使更多的卵泡能发育成熟并排卵,以提高实际生殖生产价值,研究较多的是NO对GC凋亡的抑制作用,即抑制卵泡闭锁。Najati给雌性小鼠分别皮下注射L-NAME、L-A rg和硝化甘油(nitrog lycerine)发现,L-NAME处理后的卵巢上大量卵泡发生闭锁,卵泡内GC凋亡并充斥着大量的巨噬细胞,卵母细胞形态也发生异常[20],而给予 L-A rg和 nitroglyceine处理,通过从内源或外源上增加NO浓度,都使闭锁卵泡的发生率明显的降低。还有证据表明,卵泡闭锁受到细胞死亡和细胞存活间的复杂信号调控,Fas/FasL系统就是卵泡闭锁过程中介导凋亡的关键因子之一。Chen报道NO可通过抑制由Fas/FasL介导的凋亡通路中半胱氨酸天冬酶(caspase)的激活,来抑制GC的凋亡[7]。此外,NO还可以通过促进凋亡抑制基因Bcl-2和Hsp70等的表达,以及抑制促凋亡基因Fas、P53和Bax等的表达来抑制GC凋亡,从而抑制卵泡闭锁。

3 结语

NO作为一种特殊的动物细胞间及细胞内的信息递质,在动物的各个系统、组织和器官中发挥着重要的双重生物学作用,生理剂量的NO通过激活或抑制某种酶类发挥其调节功能和信号传导作用,而高剂量的NO与 O2-作用产生过氧亚硝酸根(ONOO-)对细胞具有毒性作用。在动物的生殖方面,NO的主要作用包括促进卵母细胞的减数分裂和成熟,促进卵泡的生长发育、排卵和闭锁,参与类固醇激素的生成和分泌。此外,在黄体退化,精子发生,受精过程,胚胎的生长、发育和着床,早期妊娠及分娩等方面都发挥着重要作用。因此,NO在生殖系统方面的研究,为阐明生殖生理机制及疾病的诊治提供了新的思路和手段,具有重要的理论价值和应用前景。

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