响应面分析法优化普通茶籽中抗氧化物质的水提工艺

李起弘，郑铁松*，王华清

(南京师范大学金陵女子学院食品科学与营养系，江苏 南京 210097)

响应面分析法优化普通茶籽中抗氧化物质的水提工艺

李起弘，郑铁松*，王华清

(南京师范大学金陵女子学院食品科学与营养系，江苏 南京 210097)

以普通茶籽为研究对象，用还原能力来表示茶籽水提物的抗氧化能力。在单因素试验基础上，选取液料比、提取时间、提取温度为自变量，还原能力(吸光度)为响应值，利用Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面分析法，研究各自变量及其交互作用对还原能力的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定最佳提取条件为液料比16:1(mL/g)、提取时间1.6h、提取温度81℃。在此条件下，还原能力(吸光度)为0.616± 0.005，与预测值0.610较为一致。

普通茶籽；抗氧化；还原能力；响应面分析法

茶籽是茶树的种子，常见的有两种，一种是茶叶(Camellia sinensis)茶籽，另一种是油茶(Camellia oleifia)茶籽[1]，后者的叶子不能制茶，主要用途是取茶籽榨油[2]。国内外对油茶进行了较多研究[3-6]，但是关于普通茶籽的研究还鲜见报道。众所周知，我国是一个茶叶大国，茶树的种植几乎遍及全国。据报道，我国茶树种子的年产量可达70万吨。成熟的茶籽除繁殖茶树外，其余大部分自然脱落，在地里腐烂，造成了资源的浪费[7]。况且，随着无性繁殖的推广，普通茶籽更是成了无人问津的“废弃物”。

常用的物质抗氧化能力检测方法主要基于4种[8-9]，其中一种就是测定还原能力的方法。还原能力的测定，可检验待测物是否为良好的电子供体，待测物所提供的电子可以使Fe3+还原为Fe2+，使体系溶液颜色改变，加入待测物后，在700nm波长处根据其吸光度的变化可以得知Fe3+含量的变化[10]。待测物的还原性与吸光度大小有关，吸光度越大还原性越强。在一般情况下，物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关[11-13]，因此还原能力已被广泛应用于多糖[14]、黄酮[15]、阿魏酸[16]等多种功能性物质的体外抗氧化能力评价。

响应面分析法是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法[17]，近年来被广泛应用于众多过程的优化控制[18-20]，如化学化工、生物工程、食品工业等方面[21-24]。它与正交试验设计法不同，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点[25]。本研究在单因素试验基础上，通过响应面分析法对普通茶籽水提取物的还原能力进行工艺参数优化，确定最佳提取工艺，为普通茶籽的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通茶籽粉(诸叶种，剥去青苞、外壳，晒干磨粉，过40目筛后储存备用) 溧水县明觉镇茶厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、高氯化铁(均为国产分析纯)。

1.2 仪器与设备

AM3250B微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；722型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；LD5-10低速离心机 北京医用离心机厂。

1.3 方法

1.3.1 还原能力的测定

参照Oyaizu[26]的方法进行测定。还原能力的强弱以波长700nm处的吸光度值表示。

1.3.2 单因素试验

准确称取10.0000g普通茶籽粉，置于250mL圆底烧瓶中，在水浴锅中以蒸馏水浸提，提取物过滤，取上清液测定还原能力，以确定提取因素变化范围以及各因素的适宜值。

1.3.3 提取条件优化方案

在单因素试验基础上，选取影响较大的因素，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理[27]，用Design Expert7.0软件进行响应面优化分析[28]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对普通茶籽还原能力的影响

在温度80℃，提取时间2h的条件下，以液料比5:1、10:1、15:1、20:1、25:1(mL/g)进行试验，不同液料比对还原能力的影响见图1。

由图1可知，随着液料比的逐渐增大，还原能力先增大后减小。一般说来，液料比越高提取率也越高。但是液料比增加，会造成溶剂和能源的浪费，给后来的蒸发工序增加困难，而且成本增加。在保证提取效果的同时，应尽量减少水的用量和降低蒸发浓缩负荷[29]。并且当液料比大到一定程度时，溶剂对有效成分的浸出达到平衡状态。再增大液料比，杂质成分会竞争溶出而不利于有效成分的提取[30]。综合考虑，液料比以控制在15:1(mL/g)为宜。

图1 液料比对还原能力的影响(n=3)Fig.1 Effect of liquid/material ratio on 700 nm absorbance of reducing power (n = 3)

2.1.2 提取时间对普通茶籽还原能力的影响

在温度80℃、液料比10:1(mL/g)的条件下，以提取时间0.5、1、1.5、2、2.5h进行试验，不同提取时间对还原能力的影响见图2。

图2 提取时间对还原能力的影响(n=3)Fig.2 Effect of length of extraction time on 700 nm absorbance of reducing power (n = 3)

由图2可知，随着时间延长，还原能力逐渐增加，在1.5h前增加较明显，说明时间越短提取越不充分，在1.5h之后还原能力基本保持平缓，说明茶籽中水溶性抗氧化物质已基本提取完毕，为缩短工时、节省能源，所以选取最佳提取时间1.5h。

2.1.3 提取温度对普通茶籽还原能力的影响

在液料比10:1(mL/g)，提取时间0.5h条件下，以提取温度60、70、80、90、100℃进行试验，不同提取温度对还原能力的影响见图3。

由图3可知，随温度的逐渐升高，还原能力不断增加，在80℃前增加较为明显，原因可能是温度升高，分子热运动逐渐加快，水溶性抗氧化物质的溶出速度逐渐加快[30]。温度在80～90℃时，还原能力无显著差异，高于90℃时，又呈增大趋势。但从实际提取过程中发现，高于90℃时，提取液表面会有油性物质生成，此时的抗氧化成分不是纯粹水溶性的，可能含有油溶性的

抗氧化性物质，会造成试验误差，影响试验结果，不宜采用。综合考虑，提取温度在80℃为宜。

图3 提取温度对还原能力的影响(n=3)Fig.3 Effect of extraction temperature on 700 nm absorbance of reducing power (n = 3)

2.2 响应面法提取条件的优化

2.2.1 响应面试验设计及结果

根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取液料比、提取时间、提取温度3个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，各试验组的编码与取值见表1，试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平编码表Table 1 Variables and levels in the three-variable, three-level Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Arrangement and results of the three- variable, three-level Box-Behnken experimental design

使用Design Expert 7.0软件，以液料比、提取时间、提取温度为响应变量，以普通茶籽提取物的还原能力(吸光度)为响应值(指标值)对表2的数据进行处理，得到表3回归方程方差分析表，利用软件进行非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型如下：

Y=0.60＋0.064A＋0.021B＋0.018C－0.020AB＋0.005AC－0.012BC－0.12A2－0.057B2－0.066C2

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可以看出，该模型效应极显著(P＜0.0001)，各因素中一次项A(液料比)、二次项A(液料比)、二次项B(时间)、二次项C(温度)、交互项AB都是极显著的，其次一次项B(时间)、一次项C(温度)和交互项BC显著，交互项AC不显著。由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。R2=0.9953，说明该回归方程回归效果比较好；R2Adj=0.9893，说明可信度高；失拟项不显著，说明回归方程拟合程度良好。

根据回归方程，做出响应面分析图(图4～6)，考察所拟合的响应曲面的形状，分析液料比、提取时间、提取温度对普通茶籽提取物还原能力的影响。

2.2.2 液料比和提取时间的交互影响

图4 液料比和提取时间对还原能力影响的等高线图和响应面图Fig.4 Contour and response surface plots showing the interactive effects of liquid/material ratio and length of extraction time on 700 nm absorbance of reducing power

图4 显示了在80℃的提取温度下，液料比和提取时间对普通茶籽水溶性功能物质的还原能力的交互影响。在提取时间不变的条件下，随着液料比水平的逐渐增加，还原能力出现先上升后下降的趋势且变化较显著。这可能是当液料比变大时，原料中溶质与水中溶质在单位时间内存在较大的质量浓度梯度，扩散系数大，扩散速率大[31]。但达到一定程度后，有效组分在溶剂中的溶解达到平衡，再加大液料比则会使竞争组分溶出而不利于提取。在液料比不变的条件下，随着时间的逐渐增加，还原能力也出现了先上升后下降的趋势，但变化不大。

2.2.3 液料比和提取温度的交互影响

图5 液料比和提取温度对还原能力影响的等高线图和响应面图Fig.5 Contour and response surface plots showing the interactive effects of liquid/material ratio and extraction temperature on 700 nm absorbance of reducing power

图5 显示1.5h提取时间下，液料比和提取温度对普通茶籽水溶性功能物质的还原能力的交互影响。在液料比不变的条件下，随着提取温度的逐渐增加，还原能力出现先上升后下降的趋势。在提取温度不变的条件下，随着液料比水平的逐渐增加，还原能力也有明显的先上升后下降的趋势。这可能是因为温度的升高加速了分子热运动，而液料比的增大一方面使普通茶籽与溶剂的接触面积和接触机会也相对变大，另一方面使分子有更多的热运动空间，从而使普通茶籽中的功能性物质得到更充分地释放。

2.2.4 提取时间和提取温度的交互影响

图6 提取时间和提取温度对还原能力影响的等高线图和响应面图Fig.6 Contour and response surface plots showing the interactive effects of extraction temperature and length of extraction time on 700 nm absorbance of reducing power

图6 显示在15:1(mL/g)液料比条件下，提取时间和提取温度对普通茶籽中功能性物质的还原能力的交互影响。在提取时间不变的条件下，随着提取温度的逐渐增加，还原能力明显上升，但随后又呈下降趋势。其原因可能是原料较长时间在较高温度下提取，部分组织过热而将有效组分的结构破坏[32-33]，导致还原能力下降。在提取温度不变的条件下，随着提取时间的逐渐增加，还原能力也出现先上升后下降的趋势。

综合图4～6可知，液料比是影响普通茶籽功能性物质还原能力的最主要因素，其次是提取时间，提取温度对其影响较小。在模型浓度范围内选择出发点，按照模型使用快速上升法进行优化，提取的最佳条件为液

料比16.29:1(mL/g)、提取时间1.56h、提取温度81.37℃，在此条件下还原能力(吸光度)的理论值为0.610，可信度为0.9893。

2.2.5 最佳工艺参数的验证

为检验响应面分析法所得结果的可靠性，在上述条件下进行验证实验，考虑实际情况选取液料比16:1(mL/g)、提取时间1.6h、提取温度81℃，实际测得的吸光度为0.616±0.005，与理论预测值较为一致。因此，认为基于响应面分析法所得的优化提取工艺参数准确可靠，得到的提取条件具有一定的实际应用价值。

3 结 论

采用蒸馏水对普通茶籽中功能性物质进行提取，通过单因素试验和Box-Behnken中心组合设计原理以及响应面分析法对提取工艺进行优化，拟合了液料比、提取时间、提取温度这3个因素对还原能力的回归模型，经检验证明该模型合理可靠，能较好地预测普通茶籽中水溶性功能物质的还原能力。由该模型确定的最优工艺条件为液料比16:1(mL/g)、提取时间1.6h、提取温度81℃，在此条件下，得到普通茶籽功能性物质还原能力(实际吸光度)为0.616±0.005。

同时，试验结果表明普通茶籽的水提物具有很好的还原能力，说明普通茶籽中可能含有相关的抗氧化功能活性物质，如酚类、多糖等。目前，国内外对普通茶籽的研究未见报道，因此，为了更好地说明普通茶籽的抗氧化功能，需对其水溶性活性物质做进一步的分离纯化及鉴定。

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Response Surface Methodology for Optimization of Water Extraction Conditions of Antioxidant Compounds from Camellia sinensis Seeds

LI Qi-hong，ZHENG Tie-song*，WANG Hua-qing
(Department of Food Science and Nutrition, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Camellia sinensis seed powder was extracted with hot water to obtain bioactive compounds with reducing power and three extraction parameters including liquid/material ratio, length of extraction time and extraction temperature were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum reducing power (reflected by 700 nm absorbance of the reaction system). A mathematical quadratic polynomial regression equation reflecting the relationship between extract reducing power and the above extraction parameters was set up. The optimal extraction parameters were found as follows: liquid/material ratio (mL/g) 16:1; extraction temperature 81 ℃; and length of extraction time 1.6 h. Under the optimized conditions, the actual 700 nm absorbance of reducing power was 0.616 ± 0.005, close to the predicted value of 0.610.

Camellia sinensis seeds；antioxidation；reducing power；response surface methodology

R151.3

A

1002-6630(2010)18-0170-05

2010-06-30

李起弘(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物化学。E-mail：connie8512@hotmail.com

*通信作者：郑铁松(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物化学。E-mail：tieszheng@sina.com