响应面分析法优化海金沙草多糖的提取工艺

武 芸，郑小江*，卜贵军，曾 智

(湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

响应面分析法优化海金沙草多糖的提取工艺

武 芸，郑小江*，卜贵军，曾 智

(湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

利用响应面分析法对海金沙草多糖的提取工艺进行优化。在单因素试验基础上选取试验因素与水平，根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，确定各工艺条件的影响因素，以海金沙多糖提取率为响应面和等高线，在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出海金沙多糖浸提的最佳工艺条件为温度92℃、料液比1:25、浸提时间2.1h。在最佳提取条件下，提取2次，海金沙草的多糖得率为16.475%。

海金沙；多糖；提取；响应面分析法

海金沙草是蕨类植物海金沙科(Lygodiaceae)海金沙属(Lygodium)多年生蕨类植物海金沙(Lygodium japonicum (Thunb.))的地上部分[1-2]，全草或者成熟孢子入药，味甘淡，性寒，有清热解毒，利水通淋的功效，为治疗尿路感染、尿路结石、湿热肿满、肾炎水肿、肠炎痢疾、皮肤湿疹、咽喉肿痛等症的常用中药[3]。海金沙在临床上用于治疗扁桃体炎、乳腺炎、丹毒、带状疱疹、胃脘疼和婴儿腹泻等症状[4]，并已作为一种中草药应用于防治肿瘤等疾病。海金沙多糖是海金沙的有效成分之一，现代药理学与生物活性研究表明，许多植物多糖具有调节机体免疫、影响造血系统、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等作用。临床上和畜牧业中具有广阔的应用前景。在临床上，多糖具有安全性高、副作用小、适用面广、对机体损害小、即可注射又可服用等优点，海金沙多糖对普通变形杆菌和稻瘟病病原菌有较强的抑制活性[5]，因此，将海金沙多糖开发为天然药物免疫促进剂和调节剂应用于疾病防治方面具有广阔的应用前景。此外，海金沙多糖具有多种生物学功能，将其开发应用于饲料添加剂，对减少抗生素等药物添加剂在饲料中的使用，保证畜产品安全和我国畜牧业可持续发展具有重要意义。

目前，对海金沙多糖提取工艺的研究很少，本研究采用热水浸提法对海金沙多糖的提取进行单因素试验，应用响应面法来确定海金沙多糖的最佳提取工艺，具有试验周期短，求得回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点[6-9]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海金沙草采自湖北民族学院校园。

95%乙醇、无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、标准葡萄糖等(所有试剂均为分析纯) 恩施州人合科贸有限责任公司；所用水为双蒸水。

1.2 仪器与设备

植物样品粉碎机、756MC-紫外分光光度计、HWS12电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；DGX型电热鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司。低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂；SZ-93双重蒸馏水器 上海亚荣生化仪器厂；FA1004电子天平。

1.3 海金沙多糖热水提取

多糖提取工艺流程：称样品(1.0g) →用热水提取→离心取上清液，并定容到50mL→取5mL上清液加无水乙醇20mL于4℃过夜→5000r/min离心去除上清液，将沉淀物溶解并定容到10mL→取5mL溶液去蛋白质→取2mL溶液测其吸光度。

1.4 去除蛋白质

采用Sevag试剂来除蛋白质：将样品、三氯甲烷、正丁醇按25:5:1的比例混合并振荡20min，然后5000r/min离心15min，取上清液即可。

1.5 标准曲线的绘制

精密称取干燥至质量恒定的标准葡萄糖标准品17mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖对照品贮备液。

每管加入葡萄糖标准液和双蒸水后立即混匀，待各管都加入苯酚试剂后，迅速摇匀，然后迅速加入浓硫酸5mL于各试管中摇匀，之后置于40℃水浴中，准确加热15min后，立即取出置于流水中冷却10min。再取出所有试管用1cm口径的比色皿，以第一管为空白，迅速测定其余各管的吸光度。以糖的质量分数为横坐标、吸光度(A480nm)为纵坐标，绘出相关标准曲线并得出线性回归方程：y=0.7940x－0.0304，R2=0.9990。

1.6 多糖得率计算

按标准曲线计算得多糖含量[10]。多糖含量与原料样品比值为多糖得率。

1.7Box-Benhnken中心组合试验设计

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[11]，综合单因素试验结果，选取提取温度、料液比、浸提时间对海金沙多糖提取率影响显著的三个因素，采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计(表1)。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Variables and levels in the response surface design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 浸提时间对海金沙多糖提取率的影响

精确称取5份海金沙样品粉末各1.0g，在温度80℃、料液比1:20条件下，各样品分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，提取1次，结果见表2。从多糖得率和节约的角度综合考虑提取2h比较适宜。

表2 浸提时间对多糖提取率的影响Table 2 Effect of extraction duration on polysaccharide yield

2.1.2 料液比对海金沙多糖提取率的影响

料液比对提取率具有重要的影响，水量多有利于多糖的扩散传质，但水量过多会增加蒸发处理的困难。固定温度80℃、各样品分别按料液比1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，提取2.0h，结果表明(表3)：在料液比1:25、1:30、1:35时，多糖得率很相近，因此选取料液比1:25较好。

表3 料液比对多糖提取的影响Table 3 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharide yield

2.1.3 温度对海金沙多糖提取率的影响

研究温度对多糖提取率的影响：料液比1:25、分别在60、70、80、90、100℃提取2.0h，提取1次，结果(表4)显示：温度为90℃时多糖得率最高。

表4 温度对多糖提取率的影响Table 4 Effect of temperature on polysaccharide yield

2.1.4 提取次数对海金沙多糖提取率的影响

提取次数决定操作的成本，操作次数越多，成本

也就越高，且工艺用水量大。在浸提时间2.0h、温度80℃、料液比1:25条件下，提取4次，结果(表5)显示：提取两次以后多糖得率很少，从节约时间和能源的角度考虑可以忽略不计。综上所述，单因素试验表明：热水提取海金沙多糖的最佳温度90℃，提取时间2.0h，料液比1:25，多糖得率最高，提取次数为两次可以提取较彻底。

表5 浸提次数对多糖提取率的影响Table 5 Effect of extraction number on polysaccharide yield

2.2 响应面法优化海金沙多糖提取工艺条件

2.2.1Box-Benhnken中心组合试验

表6 响应面试验设计与结果Table 6 Response surface design arrangement and experimental results

表7 3次试验所得多糖提取率平均值的响应值估计回归系数结果Table 7 Estimated regression coefficient and significance of each term of the developed regression equation with polysaccharide yield as a function

以3次试验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y)，试验设计与结果见表6(其中15个试验中，1～12是析因试验，13～15是中心试验，用来估计试验误差)。所得结果用响应面分析软件分析，结果显示：温度、料液比、浸提时间的一次方及其二次方以及浸提时间和料液比对海金沙多糖的提取率影响都极显著(P＜0.01)，温度与浸提时间的0.01＜P＜0.05，对海金沙多糖的提取率影响显著。

通过软件分析得到海金沙多糖得率为响应值的最优方程为：

表8 回归方程的方差分析Table 8 Analysis of variances for polysaccharide yield with various extraction conditions

由表8可知，各因素线性及二次项对响应值的影响都是极显著的。同时可以看出，回归方程也是极显著的，相关系数R2=55.3038/55.5676=0.9953，说明响应值(提取率)的变化有99.53%来源于所选变量，即温度、料液比、浸提时间。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取条件。

2.2.2 各因素间的交互作用

根据以上回归方程，利用Design-Expert软件作不同因素的响应面分析图(图1～3)。

图1 浸提温度(X1)和料液比(X2)对海金沙多糖得率的影响Fig.1 Response surface plot of polysaccharide yield as a function of extraction temperature and solid/liquid ratio

图2 浸提温度(X1)和浸提时间(X3)对海金沙多糖得率的影响Fig.2 Response surface plot of polysaccharide yield as a function of extraction temperature and duration

图3 浸提时间(X3)和料液比(X2)对海金沙多糖得率的影响Fig.3 Response surface plot of polysaccharide yield as a function ofextraction duration and solid/liquid ratio

从图1～3可以直观看出，各因素交互作用对响应值的影响，以确定最佳因素水平范围。根据以上Box-Benhnken的中心组合试验，得到海金沙的最佳提取工艺条件为：温度92℃、料液比1:25、浸提时间2.1h。

对回归方程求一阶偏导数等于零，整理可得如下3式：

由式(1)(2)(3)得知，X1=0.196，X2=0.070，X3=0.198，对应真实值为浸提温度91.96℃、料液比1:25.35、浸提时间2.099h。但考虑到实际操作的便利，将海金沙多糖的最佳提取条件修正为提取温度92℃、料液比1: 25、浸提时间2.1h。

2.3 验证实验

精确称取三份海金沙草干粉1.0g于三角瓶中，加入25mL蒸馏水，在92℃水浴中加热2.1h，提取1次，测得其多糖平均得率为13.439% ；第2次提取，多糖平均得率为3.036(表10)，与上述试验所得结果比较接近，这说明试验拟合情况较好，实验误差小。因此，该分析方法符合实验要求，可以用来作为优化多变量系统的有效试验工具。

表9 验证实验结果Table 9 Verification of optimal extraction conditions for water-soluble polysaccharides from the shoot of Lygodium japonicum

3 结 论

本研究根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理，应用响应面分析方法优化提取温度、料液比和浸提时间对海金沙草多糖提取的工艺条件。结果表明，海金沙草多糖浸提的最佳工艺条件为温度92℃、料液比1:25、浸提时间2.1h。在最佳提取条件下，浸提2次，海金沙草的多糖得率为16.475%。

[1]国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999: 443.

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Extraction Optimization of Water-soluble Polysaccharides from the Shoot of Lygodium japonicum Using Response Surface Methodology

WU Yun，ZHENG Xiao-jiang*，BU Gui-jun，ZENG Zhi
(Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Based on single factor studies, a three-variable, three-level Box-Benhnken experimental design and response surface methodology were employed to optimize the extraction process of water-soluble polysaccharides from the shoot of Lygodium japonicum. Response surface and contour plots with polysaccharide yield as a function were obtained, and process conditions were analyzed for their significance for polysaccharide extraction and significance analysis of their interactions was also done. Extraction temperature of 92 ℃ and solid/liquid ratio of 1:25 for twice extraction for 2.1 h each time were found optimal. Under such conditions, a polysaccharide yield of 16.475% was obtained.

Lygodium japonicum；polysaccharide；extraction；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2010)18-0108-04

2010-06-18

国家民委科研项目(08HB04)；湖北省科技厅创新团队项目(2009CDA155)；2010年恩施州科技指导项目

武芸(1971—)，女，讲师，硕士，主要从事植物及天然产物开发研究。E-mail：wuyun2058@sohu.com

*通信作者：郑小江(1958—)，男，教授，主要从事植物学研究。E-mail：hbzxj123@126.com