奶酪及乳清中β-内酰胺酶的检测

刘晓川，喻东威，赵 源，刘志楠，薛志清，李 梅

(内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500)

奶酪及乳清中β-内酰胺酶的检测

刘晓川，喻东威，赵 源，刘志楠，薛志清，李 梅

(内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500)

为探讨原奶中β-内酰胺酶在制作奶酪过程中的去向，向无抗无酶的原奶中添加β-内酰胺酶，使其终水平为50U/mL，按照工艺制作原生奶酪，用E50法和杯碟法检测奶酪和乳清中的β-内酰胺酶。结果显示，奶酪中β-内酰胺酶检测结果为阴性，乳清中β-内酰胺酶检测结果为阳性，β-内酰胺酶在奶酪制作中主要残留在乳清中。

奶酪；乳清；β-内酰胺酶；E50法；杯碟法

不法分子向原奶中添加β-内酰胺酶[1-7]可以掩盖原奶抗生素残留的检测[8-10]，使不合格的原奶充当合格原奶从而进入乳制品的生产环节。β-内酰胺酶作为国家禁止的添加物，现行的检测方法主要有直接法和间接法[11]。本实验拟采用间接法(E50法、杯碟法)[12-13]对β-内酰胺酶在制作奶酪工艺中的去向进行探讨，根据实验结果分析β-内酰胺酶是否会随奶酪工艺残留在原生奶酪中，从而明确奶酪产品检测β-内酰胺酶是否可行。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

原奶、新西兰复原乳、β-内酰胺酶(酶活300万U/mL) 中国药品生物制品检定所；青霉素钠 华北制药厂；E50试剂盒 上海千慕公司；溴甲酚紫葡萄糖半固体微孔板(未包被嗜热脂肪芽孢杆菌)(参照GB/T 4789.27—2008《食品卫生微生物学检验：鲜乳中抗生素残留检验》附录A5配制后，加入无菌的微孔板，待凝固后即可使用)；抗生素检测试剂盒(商品名：Twinsensor)北京优尼塞斯公司；藤黄微球菌标准菌株 CMCC(B) 28001 国家医学菌种保藏管理中心。

HV-110高压灭菌锅 日本Hirayama公司；MMM生化培养箱 德国Friocell公司；VS-1300L-U洁净工作台 苏净集团安泰公司；MS3旋涡混合仪 德国IKA公司；W20M-2E恒温水浴箱 美国Shellab公司；E50试剂孵育器、Twinsensor试剂孵育器。

1.2 方法

1.2.1 原奶抗生素和β-内酰胺酶检测

用Twinsensor检测原奶的抗生素和β-内酰胺酶，合格后用于制作原生奶酪。

1.2.2 奶酪制作工艺流程

合格原奶(未添加β-内酰胺酶和添加β-内酰胺酶)→巴氏灭菌(75℃、15s)→冷却→加发酵剂、CaCl2、凝乳酶→凝乳→切割→沉降→升温搅拌→保温搅拌→排乳清→堆积→加盐→压榨→原生奶酪

1.2.3 巴氏灭菌对β-内酰胺酶的影响

向原奶中添加β-内酰胺酶使其终水平为3U/mL，将原奶进行巴氏灭菌(75℃、15s)，用Twinsensor检测β-内酰胺酶。

1.2.4 80℃加热处理对β-内酰胺酶的影响

向原奶添加β-内酰胺酶使其终水平为3U/mL，将原奶在80℃水浴中加热0、1、2min，用Twinsensor检测β-内酰胺酶。

1.2.5 奶酪中β-内酰胺酶检测

分别称取原生奶酪(由原奶和添加β-内酰胺酶的原奶制作)20g于研钵中，加入40g海砂研磨至奶酪和海砂均匀混合，然后加入20mL蒸馏水继续研磨至均匀的糊状，移入50mL离心管中3000×g离心10min，将上清液分别移入两个洁净的容器中并调节pH值到6.4～6.7，待用。

取适量的奶酪(原奶制作)上清液分别在80℃水浴中加热0、1、2min，各吸取50μL加入到溴甲酚紫葡萄糖半固体微孔中，置于37℃孵育器中培养2h50min(时间同E50培养时间)，观察结果。

分别取适量的奶酪(由原奶和添加β-内酰胺酶的原奶制作)上清液置于80℃水浴中加热1min灭活残留菌体，用E50法检测β-内酰胺酶。同时取适量奶酪(原奶制作)上清液，添加β-内酰胺酶使其终水平为2U/mL，置于80℃水浴中加热1min灭活残留菌体，用E50法检测β-内酰胺酶。

分别取适量奶酪(由原奶和添加β-内酰胺酶的原奶制作)上清液用杯碟法检测β-内酰胺酶。同时取适量奶酪(原奶制作)上清液，添加β-内酰胺酶使其终水平为1U/mL，用杯碟法检测β-内酰胺酶。

1.2.6 乳清中β-内酰胺酶检测

将乳清(原奶制作奶酪时收集和添加β-内酰胺酶的原奶制作奶酪时收集)的pH值调节到6.4～6.7，待用。

取适量的乳清(添加β-内酰胺酶的原奶)、10倍稀释的乳清、17倍稀释的乳清置于80℃水浴中加热1min灭活残留菌体，用E50法检测β-内酰胺酶。

取适量的乳清(添加β-内酰胺酶的原奶)、10倍稀释的乳清、17倍稀释的乳清用杯碟法检测β-内酰胺酶。同时取适量乳清(原奶)添加β-内酰胺酶使其终水平为1U/mL，用杯碟法检测β-内酰胺酶。

2 结果与分析

2.1 原奶抗生素和β-内酰胺酶检测

图1 原奶抗生素和β-内酰胺酶的检测结果Fig.1 Antibiotics andβ-lactamase test results of raw milk

经检测(图1)原奶抗生素呈阴性、β-内酰胺酶呈阴性，原奶合格。

2.2 巴氏灭菌对β-内酰胺酶的影响

图2 巴氏灭菌对β-内酰胺酶的影响Fig.2 Effect of pasteurization onβ-lactamase residual

由图2可知，巴氏灭菌(75℃、15s)对β-内酰胺酶几乎没有产生影响。

2.380 ℃加热处理对β-内酰胺酶的影响

图3 80℃加热对β-内酰胺酶的影响Fig.3 Effect of heat treatment at 80 ℃ onβ-lactamase residual

由图3可知，80℃加热1～2min对β-内酰胺酶几乎没有产生影响。

2.4 奶酪中β-内酰胺酶的检测

2.4.180 ℃灭菌实验

图4 奶酪(原奶制作)上清液80℃灭菌实验结果Fig.4 Sterilization results of cheese (raw milk) up liquid by heat treatment at 80 ℃

由图4可知，未加热的奶酪(原奶制作)上清液培养后产酸使pH指示剂变黄，加热后样品中制作奶酪时残留的菌体被灭活，不产酸则pH指示剂不变色。80℃加热1～2min可灭活奶酪中残留的菌体。

2.4.2 E50法检测

由图5可知，复原乳抗生素和β-内酰胺酶为阴性，对照符合实验要求。原生奶酪(原奶制作)β-内酰胺酶为阴性，原生奶酪(添加β-内酰胺酶的原奶制作)β-内酰胺酶为阴性，原生奶酪(原奶制作)+2U/mLβ-内酰胺酶为阳性。

图5 奶酪E50法检测结果Fig.5 Detection results of cheese by E50 method

2.4.3 杯碟法检测

图6 奶酪杯碟法检测结果Fig.6 Detection results of cheese by Oxford cup method

图6 的抑菌圈直径差值测量及判定结果如表1所示。

表1 奶酪杯碟法实验结果Table1 Diameter of inhibition zone and β-lactamase of cheese by Oxford cup method

2.5 乳清中β-内酰胺酶的检测

2.5.1 E50法检测

图7 乳清E50法检测结果Fig.7 Detection results of whey by E50 method

由图7可知，复原乳抗生素和解抗酶为阴性，对照样品符合实验要求。乳清β-内酰胺酶检测结果为阳性，10倍稀释的乳清β-内酰胺酶检测结果为阳性，17倍稀释的乳清β-内酰胺酶检测结果为阴性。

2.5.2 杯碟法检测

图8 乳清杯碟法检测结果Fig.8 Detection results of whey by Oxford cup method

图8 的抑菌圈直径差值测量及判定结果如表2所示。

表2 杯碟法实验结果(乳清)Table2 Diameter of inhibition zone andβ-lactamase of whey by Oxford cup method

3 结 论

添加2U/mLβ-内酰胺酶的奶酪上清液经E50法检测β-内酰胺酶阳性，单纯奶酪上清液经E50法检测β-内酰胺酶阴性。添加1U/mLβ-内酰胺酶的奶酪上清液经杯碟法检测β-内酰胺酶阳性，单纯奶酪上清液经杯碟法检测β-内酰胺酶阴性。

β-内酰胺酶是水溶性蛋白质，在制作奶酪时不会

与酪蛋白一起变性沉淀，而会留在乳清液中，按工艺流程一起排出，用E50法和杯碟法检测，乳清和10倍稀释的乳清均为阳性，杯碟法检测中乳清两杯(A杯、B杯)抑菌圈平均直径相差较大，由此得知β-内酰胺酶主要残留在乳清中。奶酪经压榨后含水量很低，故β-内酰胺酶残留量亦很小，添加50U/mL的β-内酰胺酶用目前的E50法和杯碟法均无法检出，回归到实际生产中，在β-内酰胺酶酶残留量很小的情况下，目前的两种方法均无法检出。

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Detection and Analysis of β-Lactamase in Cheese and Whey

LIU Xiao-chuan，YU Dong-wei，ZHAO Yuan，LIU Zhi-nan，XUE Zhi-qing，LI Mei
(Inner Mongolia Mengniu Dairy (Group) Co. Ltd., Hohhot 011500, China)

To explore the destination of the β-lactamases of raw milk in the process of cheese, antibiotics and β-lactamasefree raw milk was mixed with β-lactamases to a final concentration of 50 U/mL. Then the raw milk was processed to cheese according to the general procedure, and β-lactamase in the cheese and whey was determined by using E50 method and Oxford cup method. The result of β-lactamase is negative in the cheese and positive in the whey. So β-lactamase is mainly left in whey in the processing of cheese.

cheese；whey；β-lactamase；E50 method；Oxford cup method

TS252.7

A

1002-6630(2010)22-0336-04

2009-10-09

刘晓川(1982—)，男，工程师，硕士，研究方向为乳及制品生物学。E-mail：xiaochuan54613@163.com