响应面优化超声波提取山毛豆抑菌物质条件研究

胡林子，蒋 雨，马永全，于 新,*

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161；2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；3.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

响应面优化超声波提取山毛豆抑菌物质条件研究

胡林子1,2，蒋 雨3，马永全2，于 新2,*

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161；2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；3.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

考察料液比、提取时间、提取溶剂对超声波法提取山毛豆种子中抑菌物质的影响。在单因素试验基础上，利用响应面分析法对山毛豆抑菌物质的提取工艺进行优化。结果得到山毛豆抑菌活性物质的最佳提取工艺条件为液料比12:1(mL/g)、乙醇体积分数55%、超声波提取52min。该条件下质量分数为20%的山毛豆提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为20.24mm，与理论最优值20.70mm接近。

山毛豆种子；超声波提取；抑菌活性；响应面法；工艺条件

Abstract：Ultrasonic wave was applied for extraction of effective component fromTephrosia vogeliiHook f. seeds. Effects of liquid/material ratio, extraction time and ethanol concentration on the antimicrobial effect of the extract were investigated. On the basis of single factor tests, the method of response surface analysis (RSA) with three factors and three levels was adopted.Results showed that the optimum conditions were as follows:liquid-to-material ratio 12:1 mL/g, the ethanol concentration 55%and the ultrasonic processing time 52 min. Under these conditions, the inhibition zone of 20% original concentrated extract forStaphlococcus aureusreached up to 20.24 mm, which was in close agreement of the predicted value(20.70 mm).

Key words：Tephrosia vogeliiHook f. seeds；ultrasound-assisted extraction；antimicrobial activity；response surface methodology；technological conditions

非洲山毛豆(Tephrosia vogeliiHook f.)又称福氏灰毛豆、窝氏灰叶，属豆科，蝶形花亚科，灰叶属，多年生灌木，是一种优良的水土保持、荒坡绿化、土壤改良植物[1-3]。非洲山毛豆种子含有粗脂肪13.47%(m/m)，其中，不饱和脂肪酸的含量达66.94%(m/m)，粗蛋白含量38.73%(m/m)，是潜在的食品与饲料优质资源[4]。非洲山毛豆含有鱼藤酮类化合物，是一种优良的杀虫植物，其杀虫活性的发现、研究和应用在国内外已有70多年历史[5]，前人研究了非洲山毛豆叶、茎提取鱼藤酮类物质作为生物杀虫剂使用，效果良好，但是对于山毛豆种子、叶茎提取物的抑菌作用的研究尚未见研究报道。应用超声技术来强化提取过程，可有效提高提取效率，缩短提取时间，节约成本，甚至还可以提高产品的质量和产量。目前超声提取技术己在对某些天然植物的提取中得到了工业化应用[6-7]。本实验用响应面分析法(RSM)优化超声波辅助提取非洲山毛豆种子的抑菌活性物质的工艺条件，旨在为山毛豆资源的利用及天然抑菌剂的开发提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山毛豆种子，采自广州市花都区北兴镇山坡(北纬23°27′，东经113°26′)；大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 华南农业大学食品微生物实验室；乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphiB. CMCC50094) 广东省微生物研究所；培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

无水乙醇、N a O H、H C l、琼脂、N a2HPO4、NaH2PO4、NaCl(均为分析纯)；牛肉膏、蛋白胨(均为生化试剂)。

1.2 仪器与设备

MJ-176NR型多功能粉碎机 日本松下电器产业株式会社；DHG-9140A型电热恒温干燥箱 广东环凯微生物科技有限公司；R系列旋转薄膜蒸发仪 无锡星海生化设备有限公司；电热恒温培养箱 上海索普仪器有限公司；SW-CJ-IF型无菌超净工作台 苏州净化设备有限公司；KQ5200型超声波清洗器 厦门中村光学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制备

除去杂质的山毛豆，粉碎过40目筛，取100g。称样置于烧杯中，加入提取剂，于50W的超声条件下辅助浸提，4层纱布过滤，真空抽滤，用旋转薄膜蒸发仪在60℃减压浓缩，得黑红色黏稠物10mL，0～4℃储存备用。

1.3.2 试验方案

以不同液料比、超声波处理时间、提取剂浓度为因素，以抑菌圈直径为指标，根据单因素确定显著水平，在此基础上，选择一种菌作为指示菌，采用Design Expert 7.0统计分析软件的响应面分析法设计试验，以获取最适工艺参数[8]。

1.3.3 抑菌效力的测定

1.3.3.1 菌悬液制备

在无菌条件下，将供试菌种接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养24h，挑取菌落，用无菌生理盐水稀释，获得1.0×106～1.0×107CFU/mL的菌悬液，备用[9]。

1.3.3.2 提取物抑菌作用的测定

用无菌水将山毛豆提取物稀释至20%(V/V)。采用管碟法[10]，取无菌培养皿(直径90mm、高18mm)，每皿加入2%的琼脂作底层。在培养基内等距离分散放置两个牛津杯(内径6mm，外径8mm，高10mm)，将菌悬液加入到温度适宜的培养基中，混匀后迅速倒入培养皿，每皿约倒培养基15mL，静置20min后待培养基凝固取出牛津杯，用移液枪分别移取样品溶液150μL加入到平板杯孔中，每个菌种每种提取物做4组平行，以与稀释试样含同样浓度的乙醇为空白对照。37℃培养12h，用直尺以十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值，记录结果。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对提取物抑菌效果的影响

以50%乙醇为溶剂，一次性提取，液料比分别为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL/g)，超声提取40min，结果见图1。在液料比5:1～15:1(mL/g)范围内，山毛豆提取物抑菌作用呈增强趋势；当液料比大于15:1(mL/g)时，呈缓慢减弱的趋势。因此，较佳的液料比介于10:1～15:1(mL/g)。

图1 液料比对抑菌效果的影响Fig.1 Effects of liquid-to-material ratio on antibacterial activity of extract

2.1.2 提取时间对提取物抑菌效果的影响

在提取剂为50%乙醇，液料比10:1(mL/g)的条件下，超声提取20、40、60、80、100、120min，提取液抑菌结果见图2。

图2 超声波提取时间对抑菌效果的影响Fig.2 Effects of ultrasound processing time on antibacterial activity of extract

山毛豆提取物的抑菌效果随着超声提取时间的延长呈先增强后减弱的趋势，这主要是由于开始时原料和溶剂之间的浓度差比较大，扩散速度快，有效抑菌成分浸出速度也快，但随着时间延长，一方面溶剂的挥发，另一方面非抑菌成分的溶出，造成了山毛豆提取物抑菌效果的下降。因此，选取40min为最佳超声波提取时间。

2.1.3 乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响

液料比10:1(mL/g)，乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%，超声提取40min。提取物抑菌效果见图3。

图3 乙醇体积分数对抑菌效果的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on antibacterial activity of extract

在其他条件相同的情况下，当乙醇体积分数介于30%～50%时，山毛豆提取物的抑菌效果随乙醇体积分数的增加而明显增强。当乙醇体积分数大于50%时，抑菌效果随体积分数的增加而显著减弱。因此，选取50%左右为提取溶剂的最佳体积分数。

2.2 响应面法优化试验

2.2.1 试验设计及模型分析

依据Design Expert 7.0软件，采用Central Composite Design建立数学模型[11]，以液料比(X1)、浸提时间(X2)、乙醇体积分数(X3)值为自变量，以+1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX对自变量进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of RAS test

以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定抑菌圈直径，重复3次，取平均值为响应值(Y)，测定结果见表2。

表2给出了山毛豆提取物的抑菌试验结果及其预测值。依据Design Expert 7.0软件中的Central Composite Design方法，以液料比、超声提取时间、乙醇体积分数为因素设计响应面试验，对试验设计中各组提取物的抑菌效果进行回归分析，得回归方程为：

式中：Y为抑菌圈的预测值；x1～x3分别为上述3个自变量的编码值。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results

对模型进行方差分析(表3)、模型系数显著性检验(表 4)。

表3 回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

从该方程的方差分析(表3)可知，本试验所选模型不同处理间差异极显著(P＜0.0001)，说明回归方程应变量与全体自变量之间的相关关系是显著的，即这种试验方法是可靠的；失拟项P=0.3767＞0.05，失拟项差异不显著，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小，可以用该方程对不同提取条件下的抑菌效果进行预测。本试验中，变异系数较低(2.78%)，说明了试验可靠性强；模型的校正决定系数，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。该模型的信噪比(RSN)为16.094，远大于4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对提取物的抑菌效力进行预测。可以用此模型对超声波提取山毛豆抑菌成分的工艺进行优化和预测。

表4 回归方程模型系数的显著性检验Table 4 Significance test of regression coefficient

由表4可知，模型一次项x2(P＜0.0001)差异极显著，x3(P=0.0232)差异显著，x1(P=0.1320)差异不显著；二次项差异极显著；交互项x1x2(P=0.0161)差异显著，x1x3(P=0.0021)差异极显著，x2x3(P=0.2960)差异不显著。表明超声时间、乙醇体积分数对山毛豆提取物抑菌效应影响显著，且在液料比与超声时间、液料比与乙醇浓度之间存在交互作用。x1、x2、x3系数估计值分别为－0.23、1.27、0.37，影响因素主次顺序为时间＞乙醇体积分数＞液料比。

2.2.2 响应面分析与优化

图4 液料比、时间对抑菌效力影响的响应面Fig.4 Response surface showing the effect of liquid/material ratio and time on antibacterial effect of the extract

模型的响应面图解结果见图4～6。各图表示Xl、X2、X3中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对提取物抑菌能力的影响[12-13]。从图中可知，液料比和乙醇体积分数的交互作用相对其他因素之间的交互作用最大，而时间和乙醇体积分数之间的交互作用最小。

图5 液料比、乙醇体积分数对抑菌效力影响的响应面Fig.5 Response surface showing the effect of liquid-to-material ratio and ethanol concentration on antibacterial effect of the extract

图6 时间、乙醇体积分数对抑菌效力影响的响应面Fig.6 Response surface showing the effect of time and ethanol concentration on antibacterial effect of the extract

用Design-Expert软件对试验模型进行典型性分析，以获得最优的提取条件。经分析，X1、X2、X3最适值分别为12.08mL/g、52.18min、55.05%，理论抑菌圈直径为20.7014mm。

2.3 最优条件的验证

将提取条件修正为液料比12:1(mL/g)、提取时间52min、乙醇体积分数55%，以验证响应面法优化条件的可靠性。在优化条件下，重复实验5次，取平均值。实验测得抑菌圈直径为20.24mm，与模型预测值相差2.23%。证明该模型具有一定的可靠性。

3 结 论

采用超声波提取技术对山毛豆抑菌活性物质进行了提取，通过单因素试验和响应面分析对超声波提取工艺进行优化，结合实际可操作性得出较优工艺条件为液料比12:1(mL/g)，提取时间52min、乙醇体积分数55%。该条件下的山毛豆提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径为20.24mm，与模型预测值接近。

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Ultrasound-assisted Extraction of Antimicrobial Substances fromTephrosia vogeliiHook f. Seeds

HU Lin-zi1,2，JIANG Yu3，MA Yong-quan2，YU Xin2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)22-0091-05

2010-01-11

胡林子(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白质工程。E-mail：hulinzi-lny@163.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn