富血红素多肽产物制备用酶的比较研究

杨万根，王卫东，孙会刚，马美湖*

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

富血红素多肽产物制备用酶的比较研究

杨万根1，王卫东1，孙会刚1，马美湖2,*

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

为筛选适于生产富血红素多肽产物的蛋白酶，比较不同蛋白酶对猪血红蛋白的水解效果。在AS1398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的最适水解pH值及温度下，以L16(45)正交试验研究酶种类、酶质量分数、底物质量分数和水解时间等因素对水解率、水解液中粗多肽含量和血红素含量等指标的影响。结果表明：酶种类和水解时间两因素对水解率指标的影响达到极显著水平(P＜0.01)；底物质量分数是影响粗多肽含量指标的最重要因素；酶种类对血红素含量指标的影响则达到显著性水平(P＜0.05)。中性蛋白酶有利于提高水解率，木瓜蛋白酶有利于提高水解物的粗多肽含量，而碱性蛋白酶则有利于提高水解物的血红素含量。

猪血红蛋白；蛋白酶；多肽；血红素；筛选

Abstract：In order to screen a protease suitable for producing heme-enriched polypeptides, the effects of various proteases on hydrolysis efficiency of porcine hemoglobin were compared. Under the optimal pH and temperature of proteases such as AS1398 neutral protease, 2709 alkaline protease, papain and trypsin, orthogonal experiments were used to explore the effects of enzyme type, enzyme concentration, substrate concentration and hydrolysis time on the hydrolysis degree of porcine hemoglobin and the contents of polypeptides and heme. Results showed that the effects of enzyme type and hydrolysis time on the degree of hydrolysis reached an extremely significant level (P＜ 0.01). Substrate concentration was the most important factor to affect the content of polypeptide production. The effect of enzyme type on heme content reached a significant level(P＜ 0.05). Neutral protease is beneficial for the increase of hydrolysis degree and papain is good for the increase of polypeptide content, while alkali protease is helpful for the increase of heme content.

Key words：porcine hemoglobin；proteases；polypeptide；heme；screening

猪血红蛋白占全血蛋白质总量的2/3以上，是猪血中的重要营养成分。血红蛋白由珠蛋白和血红素两部分构成，经过现代生物酶解技术，血红蛋白在被降解成多肽的同时，释放出血红素或血红素肽[1]。已有研究证明，猪血红蛋白多肽具有降血压[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]和增强免疫力[5]等多种生物活性，血红素或血红素肽则是一种优良的补铁剂[6]。目前，国内屠宰场每年产生大量的猪血，这些猪血大部分未经利用被直接排放入环境中，既浪费了宝贵的蛋白质资源，又造成了严重的环境污染。对猪血红蛋白开展酶法生产富血红素多肽研究，能变废为宝，具有巨大的经济价值和重大环保意义。国内外对酶法水解猪血红蛋白制备富血红素多肽的研究正方兴未艾[7-8]。本实验研究酶种类、酶质量分数、底物质量分数和水解时间对水解率、水解液中粗多肽含量和血红素含量的影响，比较不同蛋白酶降解猪血红蛋白的效果，为利用屠宰厂废弃猪血制备富血红素多肽产品提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粗血红蛋白 自制[9]；木瓜蛋白酶 广州远天酶制剂厂；AS1398中性蛋白酶和2709碱性蛋白酶 北京房山酶制剂厂；胰蛋白酶 上海实验试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；LD5-2型医用离心机 北京医用离心机厂；微量凯氏定氮装置 泉州市万达实验仪器设备；JB300-D型强力电动搅拌机、DS-1型组织捣碎机 上海标本模型厂；754型分光光度计 上海分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 正交试验设计

选用L16(45)正交表[10]考察酶种类、底物质量分数、酶质量分数和水解时间等因素对水解率、粗多肽含量以及血红素含量等指标的影响，试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.2 猪血红蛋白水解方法

用适量水稀释猪血红蛋白解冻液，85℃加热30min，捣碎，加水调至一定底物质量分数，加热至蛋白酶水解温度，并调节至水解pH值，加入一定浓度的蛋白酶水解，水解过程中滴加碱液保持pH值不变。到达一定水解时间后，90℃加热15min灭酶。4000r/min离心20min得猪血红蛋白水解液。

1.3.3 酶活测定

测定方法采用福林-酚法[11]。酶活单位(U)定义为：在各蛋白酶的最适水解pH值及温度的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。

1.3.4 总氮测定

改良凯氏定氮法[12]。

1.3.5 氨基氮测定

甲醛滴定法[12]。

1.3.6 血红素含量测定

分光光度法[13]。

1.3.7 水解率公式

1.3.8 粗多肽含量测定

猪血红蛋白水解液中主要成分是多肽，另外还含有少量的游离氨基酸和未降解的蛋白质，因此测定的是粗多肽的含量。粗多肽含量=总氮含量×6.25。

2 结果与分析

2.1 正交试验

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

2.2 水解率分析

表3 水解率方差分析表Table 3 Variance analysis of hydrolysis degree

水解率的方差分析结果见如表3所示。对水解率指标，各因素的影响：酶种类＞水解时间＞底物质量分数＞酶质量分数，其中酶种类和水解时间的影响达到了极显著水平(P＜0.01)。水平均值多重比较分析显示，酶种类的影响：中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶，中性蛋白酶与其他3种蛋白酶呈极显著性差异(P＜0.01)；水解时间的影响：13h＞10h＞7h＞4h，其中13h和10h之间无显著差异(P＞0.05)，它们均与7h呈显著性差异(P＜0.05)，而7h又和4h呈显著性差异(P＜0.05)；底物质量分数的影响：6%＞8%＞10%＞4%，前三水平与4%的达到了显著性差异(P＜0.05)；酶质量分数的各水平之间无显著性差异(P＞0.05)，各水平效果：2000U/g＞6000U/g＞4000U/g＞8000U/g。因此对水解率指标，最优的因素水平组合：中性蛋白酶、底物质量分数6%、酶质量分数2000U/g、水解时间13h。

AS1398中性蛋白酶是微生物来源的蛋白酶，其水解特异性较宽，可以水解底物成小分子的肽或游离氨基酸，因此其对水解率指标影响最大。有试验证明中性蛋白酶具有较强的水解能力，如刘昭明等、邓佳等在猪血红蛋白的水解研究中发现，AS 1398中性蛋白酶比木瓜蛋白酶具有更高的水解率[15-16]。

2.3 粗多肽含量分析

表4 粗多肽含量极差分析Table 4 Range analysis of polypeptide contents

粗多肽含量的极差分析结果如表4所示。由R值比较可知，对粗多肽含量指标，各因素的重要性：底物质量分数＞酶种类＞酶质量分数＞水解时间。根据比较K值，底物质量分数各水平的的优劣：8%＞10%＞6%＞4%；酶种类各水平的优劣：木瓜蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶；酶质量分数各水平的优劣：4000U/g＞8000U/g＞6000U/g＞2000U/g；水解时间各水平的优劣：7h＞13h＞10h＞4h。因此，对粗多肽含量指标，最优的因素组合：木瓜蛋白酶、底物质量分数8%、酶质量分数4000U/g、水解时间7h。

从粗多肽含量指标来看，底物质量分数8%和10%的效果优于4%和6%，这是由于在底物质量分数小于8%时，酶还没有被底物完全饱和。据Henri解释，在低底物质量分数时，并非所有的酶分子能与底物结合；随底物质量分数的增加，酶分子与底物相结合的数量增加，当所有的酶分子与底物相结合时，这时的催化速度最大[17]。在底物质量分数10%时，猪血红蛋白形成稠状的物料，流动性差，不利酶的连续作用，因此其水解效果比底物质量分数为8%时较差。木瓜蛋白酶是提高水解物中粗多肽含量的最适酶类，其原因是该酶为内切酶，能酶切蛋白质肽链成小肽段，使水溶性固形物增多，导致粗多肽含量指标提高。胰蛋白酶同样为内切酶，但其只能催化水解底物蛋白质分子中由Lys-或Arg-残基所构成的肽键，底物特异性太强[8]，因此对粗多肽含量指标的影响要小于木瓜蛋白酶。

2.4 血红素含量分析

表5 血红素含量方差分析Table 5 Variance analysis of heme contents

血红素含量指标的方差分析结果见表5，各因素的影响：酶种类＞酶质量分数＞水解时间＞底物质量分数，且只有酶种类一项达到显著性水平(P＜0.05)，而其他因素的影响不显著(P＞0.05)。水平均值多重比较表明，酶种类各水平的优劣：碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶，且碱性蛋白酶与中性蛋白酶、胰蛋白酶之间呈显著性差异(P＜0.05)，与木瓜蛋白酶无显著性差异(P＞0.05)。其他因素的水平之间均无显著性差异，酶质量分数各水平的优劣：4000U/g＞8000U/g＞6000U/g＞2000U/g，底物质量分数各水平的优劣：4%＞10%＞8%＞6%，水解时间各水平的优劣：4h＞7h＞13h＞10h。因此对血红素指标，最优的条件组合：碱性蛋白酶、酶质量分数4000U/g、4%底物质量分数、水解时间4h。

实验中一个显著的现象是影响血红素指标的酶类顺序：碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶，它们作用的pH值依碱性到中性顺序排列。一般认为在碱性环境中，由于蛋白质分子中各基团具有相同的电荷，静电排斥作用使珠蛋白的结构伸展，暴露出珠蛋白肽键上更多的酶作用位点，从而使更多的血红素从血红蛋白中被释放出来。张亚娟[18]在研究酶法水解血红蛋白制备血红素时发现，碱性蛋白酶是制备血红素的最优酶类。孙骞等[19]报道，木瓜蛋白酶的水解液色泽要好于AS1398中性蛋白酶、胰蛋白酶等，水解液的色泽排列顺序是木瓜蛋白酶＞AS1398中性蛋白酶＞胰蛋白酶，说明木瓜蛋白酶血红素释放的能力要大于AS1398中性蛋白酶和胰蛋白酶，与本实验的结果一致。李宝臻[20]采用酶解方法对猪血球蛋白进行脱色研究时发现，在所选择的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶中，碱性蛋白酶和中性蛋白酶有较好的脱色效果，碱性蛋白酶的脱色率达到了90%以上，同样说明了碱性蛋白酶有利于血红素的释放。

3 结 论

采用酶解技术水解屠宰场废弃猪血中的血红蛋白生产富血红素多肽产品，具有重大的经济价值和环保意义。本实验比较了AS1398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解效果，考察了酶种类、底物质量分数、酶质量分数和水解时间对水解率、粗多肽含量和血红素含量等因素的影响，结果发现酶种类是影响水解率和血红素含量指标的重要因素，其对水解率指标的影响达到了极显著水平(P＜0.01)，对血红素含量指标的影响达到显著性水平(P＜0.05)。不同蛋白酶具有不同的水解效果。酶种类各水平中，对水解率指标，中性蛋白酶是最优水平；对水解物的粗多肽含量指标，木瓜蛋白酶是最优水平；对水解物的血红素含量指标，碱性蛋白酶是最优水平。本研究结果对富血红素多肽生产具有一定参考价值。

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Comparison of Proteases for Hydrolyzing Porcine Hemoglobin

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Hui-gang1，MA Mei-hu2,*
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

TS251.93

A

1002-6630(2010)22-0156-04

2010-01-24

国家自然科学基金项目(30270976)

杨万根(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：yangwangen08@163.com

*通信作者：马美湖(1957—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn