骨胶原蛋白的酶解工艺条件

2010-10-19赵妍嫣胡林林姜绍通

食品科学 2010年22期

关键词：胶原蛋白多肽胶原

赵妍嫣，胡林林，方芳，姜绍通

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009)

骨胶原蛋白的酶解工艺条件

赵妍嫣，胡林林，方芳，姜绍通

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009)

采用胰蛋白酶酶解骨胶原蛋白制备胶原多肽，通过单因素和响应面试验，以水解度为指标，确定胰蛋白酶酶解胶原蛋白的最佳工艺条件。结果表明：最优工艺条件为pH6.91、反应温度60℃、酶添加量200mg/g胶原蛋白、底物水平0.1/61.5(g/mL)、水解时间为4h；此条件下的胶原蛋白水解度达到29.36%。酶解后胶原蛋白的溶解性及乳化性均显著提高。

骨胶原蛋白；胰蛋白酶；水解度；酶解工艺

Abstract：Collagen was used as the material to prepare collagen polypeptide through enzymatic hydrolysis by trypsin. The optimal hydrolysis conditions were explored by single factor and response surface experiments on the basis of hydrolysis degree. Results indicated that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis pH of 6.91, hydrolysis temperature of 60 ℃,enzyme dosage of 200 mg per 1 g collagen, material-liquid ratio of 1:615 (g/mL), and hydrolysis time of 4 h. Under the optimal hydrolysis conditions, the hydrolysis degree of collagen was 29.36%. The solubility and emulsification capability of hydrolyzed collagen were significantly improved.

Key words：bone collagen；trypsin；the degree of hydrolysis；enzymatic hydrolysis processing

我国是畜牧和渔业养殖大国，其加工的副产物——鲜骨[1]逐年增加，造成环境污染和资源浪费[2]。新鲜的畜骨含有20%～30%的蛋白质，其中90%为胶原[3]及软骨素，是优良的蛋白源。胶原多肽是胶原经蛋白酶降解后得到的分子量约为3～20kD的具有特殊生理活性的生物活性肽[4]。它不仅提高了蛋白质类食品的价值[5]而且使一些从前难以开发的蛋白质资源以多肽类食品的形式得以利用。由于胶原多肽的高功能性、无害性、绿色性，其发展前景被看好[6]。目前关于采用蛋白酶解牛骨蛋白[7]、鱼骨蛋白[8]等制备生物活性水解物的研究较多，但有关采用酶法制备猪骨蛋白活性肽的研究报道甚少。本实验先从猪骨中提取骨胶原蛋白，利用胰蛋白酶的酶解作用将其降解为骨胶原多肽，为胶原多肽的广泛应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜猪板骨市购；胰蛋白酶(酶活11.96U/mg) 上海化学试剂总厂；碳酸氢钠、邻苯二甲酸氢钾、乙醇、甲醛、氢氧化钠、羟脯氨酸、考马斯亮蓝(均为生化级)。

1.2 理化指标的测定

溶液中的蛋白含量：考马斯亮蓝法[9]；胶原蛋白含量：羟脯氨酸法[10]；水解度：双指示剂甲醛滴定法(GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》)；胶原蛋白与胶原多肽性质：蛋白吸水性、吸油性、乳化性、乳化稳定性、发泡性和泡沫稳定性的测定参见文献[11]。

1.3 方法

1.3.1 骨胶原蛋白的提取工艺流程

新鲜猪骨(剔去肉质和肌腱)→用7 g/100 mL的NaHCO3溶液浸泡1h→用9g/100mL的NaCl溶液浸泡9h→用5倍体积的体积分数75%的乙醇溶液浸泡12h→用5倍体积的正丁醇浸泡12h→高压蒸煮3h→过滤→溶液冷冻干燥→胶原蛋白

1.3.2 胶原蛋白的酶解工艺

1.3.2.1 单因素试验

以水解度为指标，考察胰蛋白酶酶解胶原蛋白的pH值、反应温度、酶添加量、水解时间及底物水平5个因素对酶解的影响，从而确定最佳的酶解条件[12]。

1.3.2.2 响应面试验

在单因素试验基础上，采用响应面试验确定酶解胶原蛋白的最佳工艺。选用因素及水平见表1。

表1 响应面设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 结果与分析

2.1 不同因素对酶解胶原蛋白水解度的影响

2.1.1 pH值

图1 pH值对胶原蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of pH on hydrolysis degree of collagen

由图1可知，随着pH值的增加，水解度先增加再下降，在pH7时，水解度最大，当pH值小于或大于7时，酶活性会降低，从而影响水解度的变化。

2.1.2 酶添加量

图2 酶添加量对胶原蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of collagen

由图2可知，当底物水平一定时，随着酶添加量的增加，胶原蛋白的水解度先增加后减小，当酶添加量在200～400mg/g胶原蛋白时，胶原蛋白的水解度变化不太明显，这是因为当酶添加量较低时，随着酶用量的增加，胰蛋白酶对胶原蛋白的酶解作用增强，水解度增加，但当酶添加量过多时，胰蛋白酶可能自身相互水解，使得水解度呈下降趋势。

2.1.3 反应温度

图3 反应温度对胶原蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of collagen

由图3可知，温度能显著影响胰蛋白酶的活性。随着温度的增加，水解度先增加后下降，温度为65℃时水解度最高。

2.1.4 水解时间

图4 水解时间对胶原蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of collagen

由图4可知，在4h之前，随着水解时间的延长，水解度逐渐增大，且增加的幅度较大，但4h后，随着时间的延长，水解度变化不大。

2.1.5 底物水平

图5 底物水平对胶原蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree of collagen

由图5可知，随着底物水平的减小，胰蛋白酶与底物能够充分的结合，水解度逐渐增加并趋向于平缓，在底物水平为1/700(g/mL)时，水解度达到最大。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验基础上采用响应面法优选发酵条件的最佳工艺，响应面试验结果见表2。

表2 工艺优选响应面试验结果Table 2 Results of response surface experiments for optimizing hydrolysis processing

对试验数据进行多项式拟合回归，以水解度(Y)为因变量，以pH值(X1)、温度(X2)、料液比(X3)为自变量建立回归方程：

图6 pH值、反应温度、底物水平交互影响水解度的响应面图Fig.6 Response surface plots for the effects of cross-interaction among hydrolysis pH, hydrolysis temperature and substrate concentration on hydrolysis degree of collagen

为了进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，通过绘制响应面曲线图来进行直观的分析。图6分别显示了3组以水解度为响应值的趋势图，从等高线图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度。由响应面试验得出最优酶解工艺为pH6.91、反应温度60℃、底物水平0.1/61.5(g/mL)，此时水解度为29.30%。通过验证实验，水解度为29.36%，与理论值相差不大。

2.3 胶原蛋白和胶原多肽的性质研究

经检测，从猪骨中提取的胶原蛋白原料中蛋白质含量为98.22%，骨胶原蛋白的含量为86.54%。对胶原蛋白和胶原多肽的性质进行测定，结果见表3。

表3 胶原蛋白和胶原多肽的性质Table 3 Properties of collagen and collagen polypeptides

3 结论

本实验通过单因素和响应面试验确定酶解的最佳工艺条件为pH6.91、反应温度60℃、酶添加量200mg/g胶原蛋白、底物水平0.1/61.5(g/mL)、水解时间4h。此工艺条件下，水解度为29.36%。酶解后胶原蛋白的溶解性及乳化性均显著提高。

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Enzymatic Hydrolysis Processing of Collagen

ZHAO Yan-yan，HU Lin-lin，FANG Fang，JIANG Shao-tong(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

TS251

1002-6630(2010)22-0153-03