高速剪切对大豆分离蛋白限制性酶修饰的影响

齐莲子，迟玉杰*

(东北农业大学食品学院，大豆生物学省部共建教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

高速剪切对大豆分离蛋白限制性酶修饰的影响

齐莲子，迟玉杰*

(东北农业大学食品学院，大豆生物学省部共建教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

研究高速剪切预处理对大豆分离蛋白限制性酶修饰制备等电点处高分散性蛋白的影响。以酶修饰产物的水解度、分散性为指标进行综合评价，揭示水解度与分散性的关系。结果表明，以常规酶修饰为对照，高速剪切处理能有效地促进大豆分离蛋白的酶修饰，在0.5～2.0h范围内，随水解时间的延长，水解度逐渐增大，分散性也随之增加。该处理方式的最适参数为底物质量浓度100g/L、剪切速率6000r/min、剪切时间4min，该条件下酶修饰物的水解度从1.29%提高到4.16%，等电点处分散性由20.62%提高到46.82%，分别提高了3.22倍和2.27倍(P＜0.05)，并将改性时间由4.5h缩短至2.0h。

大豆分离蛋白；高速剪切；水解度；分散性

Abstract：The aims of the present study were to determine the effect of high-speed shearing before flavourzyme hydrolysis on the degree of hydrolysis (DH) of soybean protein isolate and to analyze the relationship between the DH and dispersibility of soy protein isolate (SPI) in an aqueous solution at the isoelectric point. The introduction of high-speed shearing effectively propelled the enzymatic modification of SPI with flavourzyme. As the hydrolysis time was prolonged from 0.5 to 2.0 h, both the DH and disperisibility of SPI showed a gradual rise. The optimal shearing treatment conditions were found to be:substrate concentration, 100 g/L; shearing rate, 6000 r/min; and shearing duration, 4 min, and the DH of SPI was increased from 1.92% to 4.16% and the disperisibility at the isoelectric point from 20.62% to 46.82% under these conditions, reaching 3.22- and 2.27-fold increments, respectively, but the time required for the completion of enzymatic modification was shortened from 4.5 to 2.0 h.

Key words：soy protein isolate；high-speed shearing；degree of hydrolysis；dispersibility

大豆分离蛋白(SPI)是植物蛋白中为数不多可替代牛奶、鸡蛋等动物蛋白的品种之一，具有分散性、乳化性、凝胶性等多种功能特性，广泛应用于各类食品中[1]。蛋白质强化酸性饮料pH值处于4.0～5.0，因风味良好和营养丰富逐渐被人们所青睐。但SPI在近等电点pH4.5处分散性不佳限制了其应用，因此提高SPI在其等电点附近的分散性可拓宽其应用范围。酶修饰SPI是一条制备高分散性、良好悬浮稳定性蛋白的途径。Qi等[1]利用胰蛋白酶对SPI进行酶修饰，但此方法底物浓度较低，产品得率不高，且过度水解导致苦味产生。Achouri等[2]利用中性蛋白酶修饰SPI，其等点电下pH值为4.5的分散性可达60%以上，但由于酶的添加量较高，增加了成本。Sara等[3]利用菠萝蛋白酶水解12h后改善了SPI的分散性，但水解周期过长，能耗过大。据研究发现，100g/L含量的SPI溶液经加热会凝固产生凝胶化现象[4]，高浓度、高黏度底物能够产生酶抑制作用及失活作用，导致反应速率下降[5]。因此，目前针对高浓度底物、低酶用量进行限制性酶修饰的报道较少。

高速剪切作为SPI酶修饰前的一种预处理手段。目的在于通过剪切稀释作用使高浓度、高黏度的SPI分子体系达到一定的破碎效果，以利于后期酶修饰，旨在提高水解度(DH)的同时降低酶用量，对SPI浓度、高速剪切处理条件进行研究，明确最适处理参数，为获等电点处高分散性SPI粉的生产提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(蛋白质87.11%，脂肪1.98%，水分5.84%，灰分4.95%) 哈高科大豆食品有限责任公司；风味蛋白酶(Flavourzyme) 丹麦NOVO公司；果糖、水合茚三酮等(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

B-290型喷雾干燥仪 瑞士Buchi公司；LD4-2A离心机 北京医用离心机厂；ALC-310.3电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；pHS-3C型酸度计 上海精密仪器有限公司；HYP-Ⅱ型消化炉与凯氏定氮仪上海纤检仪器有限公司；JJ-2B高速组织捣碎机 江苏荣华仪器制造有限公司；H722可见分光光度计 天津市普瑞斯仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 上海浦东物理光学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 大豆分离蛋白组分含量的测定

粗蛋白质：GB/T 5511—2003；水分：GB/T 5479—85；脂肪：GB/T 5009.6—2003；灰分：GB/T 14770—1993。

1.3.2 蛋白酶活力的测定

采用福林酚比色法[6]，经测定风味蛋白酶活力为5.0×104U/g。

1.3.3 常规酶修饰

基于风味蛋白酶(Flavourzyme)在蛋白水解中的应用条件，配制一定质量浓度的SPI溶液，置于酶反应器中，调节温度50℃、pH7.0，加0.5%(E/S)Flavourzyme进行酶修饰。反应过程中保持温度、pH值恒定。酶修饰时间设定为0.5～2.0h，每隔0.5h取样于90℃、15min钝化蛋白酶，测定DH。经喷雾干燥得到限制性酶修饰SPI粉，测定其等电点处分散性。

1.3.4 高速剪切预处理对SPI限制性酶修饰的影响。

以水解度为指标，将不同浓度的SPI溶液经高速剪切预处理一定时间，然后进行酶修饰，考察SPI浓度、高速剪切速率及时间等参数对酶修饰效果的影响。酶修饰参数同1.2.3节。

1.3.4.1 单因素试验

单因素试验的条件定为：固定SPI质量浓度120g/L，剪切速率6000r/min，剪切时间2min。改变其中一个条件，固定其他条件以分别考察SPI质量浓度、剪切速率、剪切时间对SPI水解度的影响。各因素水平见表1。

表1 单因素试验参数Table 1 Factors and levels in single factor design

1.3.4.2 正交试验

根据单因素试验确定各因素的取值水平范围，再对SPI质量浓度、剪切速率、剪切时间进行L9(34)正交试验，根据产物的DH确定最佳辅助处理条件。因素水平编码表见表2。

表2 正交试验因素水平设计Table 2 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.5 喷雾干燥条件

进风温度170℃，出风温度80～90℃。

1.3.6 分析方法

采用茚三酮法测定水解度[7]；分散性的测定[8]：称取20.00gSPI，倒入300mL蒸馏水，在4000r/min的转速下搅拌10min，取出浆液，调节pH4.5，于2700r/min、离心10min，利用凯氏定氮法测定上清液及样品中蛋白质的含量，重复3次。分散性(protein dispersibility index，PDI)表达式如下：

1.3.7 统计分析

水解度及分散性平行测定3次，采用SAS 8.1软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 高速剪切预处理对SPI酶修饰效果的影响

2.1.1 SPI质量浓度对酶修饰效果的影响

剪切速率6000r/min，剪切时间2min时，SPI底物质量浓度60～150g/L范围内水解度的变化趋势见图1。当底物质量浓度为60g/L时，水解效果最好，DH值达(3.78±0.036)%。随底物质量浓度的升高，高速剪切辅助限制性酶修饰产物的DH呈降低趋势，但在质量浓度为60～100g/L下降程度不明显，下降幅度仅为0.16%。底物浓度大于100g/L时，DH显著降低，SPI质量浓度为150g/L时，DH仅为2.72%。

在实际生产中为提高产品得率，宜采用较高底物浓度进行限制性酶修饰。因此，确定底物浓度为100g/L，此时DH为(3.62±0.037)%。

图1 蛋白液质量浓度对限制性酶修饰的影响Fig.1 Effect of SPI concentration on DH

2.1.2 剪切速率对酶修饰效果的影响

在SPI底物质量浓度为100g/L、剪切时间2min条件下，研究剪切速率对SPI水解度的影响(图2)，剪切速率在0～6000r/min内，DH随速率的升高迅速上升。当剪切速率为6000r/min时，水解2.0h时样品的DH达最大(3.60±0.022)%，比常规酶修饰时提高了2.79倍。剪切速率继续增加，水解度则开始下降。

图2 剪切速率对SPI限制性酶解的影响Fig.2 Effect of shearing rate on DH

因为经过一定速率的剪切处理，SPI结构较疏松，凝聚的蛋白质分子逐渐解缔并伸展，使酶作用位点暴露，有利于加速酶和底物结合[9]，DH增加。高速剪切作用使蛋白质大分子聚集体破碎为蛋白分子[10]，同时增加了原先包埋在分子内部的疏水基团的暴露机会。但剪切速率过大，使蛋白质聚集体产生不可逆的裂解，破坏程度加大，导致分子表观直径减少，酶解反应不完全[11]。由此，确定最适剪切速率为6000r/min。

2.1.3 剪切时间对酶修饰效果的影响

在SPI底物质量浓度为100g/L、剪切速率6000r/min条件下，1～5min剪切时间范围内SPI水解程度的变化趋势见图3，SPI水解程度在1～4min范围内随时间的升高呈上升趋势，剪切时间为3、4 min时，产物在酶解2.0h时DH增幅不明显，分别为(4.08±0.051)%和(4.12±0.043)%，再进一步延长剪切时间则D H显著降低。

图3 剪切时间对SPI限制性酶解的影响Fig.3 Effect of shearing duration on DH

随剪切时间的延长，蛋白质空间构象发生变化[10]，埋藏在蛋白质内部的活性部位暴露出来，扩大了与酶接触的机会；然而，剪切时间进一步延长，部分蛋白质的活性部位逐渐被破坏，因而酶解物的DH有所下降。综上所述，确定剪切时间为3min。

2.2 高速剪切辅助酶修饰优化试验

根据单因素试验得到的数据，以酶解物DH为指标，采用L9(34)正交试验确定最佳辅助处理参数。正交试验及方差分析结果见表3、4。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal array design matrix and experimental results

表4 正交试验方差分析Table 4 Variance analysis for DH with various shearing conditions

比较本试验中A、B、D三个因素中极差的大小，可得出B因素为最重要因素，其次为D因素，而A因素为不重要因素。三个因素的主次关系是B＞D＞A。按照各因素的最好水平选取B2D3A2，即剪切速率6000r/min、蛋白液质量浓度100g/L、剪切时间4min作为辅助处理的较优组合。剪切速率对结果影响显著，而剪切时间及底物质量浓度对结果影响不显著。

由于得到的高速剪切辅助限制性酶修饰较优组合参数在正交试验内未出现，因此补作这部分的试验，即按照剪切速率6000r/min、蛋白液质量浓度100g/L、剪切时间4min进行验证实验，测得结果：水解度为(4.16±0.082)%，分散性为(46.82±0.68)%。

2.3 水解度对分散性的影响

分散性与DH呈正相关[12-13]，据DH的测定方法，在波长570nm处测定的吸光度越大，则样品的分散性越强。本实验重点探讨SPI在等电点处分散性和DH的关系。

图4 水解度对SPI分散性的影响Fig.4 Effect of DH on disperisibility of SPI

由图4所示，经辅助处理限制性酶修饰的SPI分散性与空白对照相比有显著提高。在低DH范围内，分散性随DH的增加明显上升。因为经风味蛋白酶作用后断裂成小分子短链物质，使得氨基和羧基的数目增多，极性增加，电荷密度增大，分子间相互排斥作用增加，亲水性增强[14]，从而提高了分散性。另外，SPI经辅助处理后，蛋白质分子颗粒的表面电荷分布加强，围绕着新暴露的极性基团的结合水增多，使亲水性增强[15]。DH为4.16%时，在等电点处，改性后SPI粉的分散性可达到46.82%，提高了2.27倍。

2.4 高速剪切辅助限制性酶修饰的综合评价

表5 改性前后酶修饰结果比较Table 5 Comparison between routine and high-speed shearing-assisted enzymatic modification of SPI

由表5可见，与空白对照相比，采用高速剪切辅助进行限制性酶修饰，将改性时间由原来的4.5h减少到了2.0h，DH也基本达到一致，且经高速剪切处理辅助限制性酶修饰SPI分散性有所提高。

3 结 论

3.1 利用高速剪切的剪切稀释作用使高浓度、高黏度的SPI溶液达到一定的破碎效果。高速剪切作用对较低浓度SPI水解程度的提高更为显著。剪切速率过大导致蛋白结构破坏程度加大，增加了反应接触面，使速率有所加快。但考虑到能耗及工艺可行性因素，蛋白质分子不可能磨得过细，同时也避免因微生物繁殖而影响产品品质。剪切时间过长，使样品的机械能转化为不可逆的热能导致温度升高，蛋白过度变性，形成不溶聚合体也不利于酶修饰的进行，都会造成DH降低。

3.2 在酶修饰参数为酶添加量0.50%、pH7.0、反应温度50℃、反应时间2.0h条件下，通过正交试验确定高速剪切辅助高浓度大豆分离蛋白限制性酶修饰提高其水解效果的较优组合为剪切速率6000r/min、蛋白液质量浓度100g/L、剪切时间4min，与常规酶修饰相比，高浓度SPI、短时间内水解度从1.29%提高到4.16%，分散性从20.62%提高到46.82%，分别提高了3.22倍和2.27倍。

3.3 高速剪切作用使蛋白质大分子聚集体破碎，即打断了蛋白分子间的较弱的作用力，使得球状蛋白质内部的酶切位点暴露出来，增加与酶结合的几率。因此，通过剪切稀释作用(分子在流动的方向逐步定向，摩擦阻力下降，使得黏度降低)对高浓度、高黏度的SPI溶液进行酶修饰前预处理，辅助其进行限制性酶修饰，在短时间内提高DH，避免苦味肽的产生，并提高其分散性，具有一定的可行性。

3.4 随DH的增加，辅助限制性酶修饰SPI粉在其等电点处的分散性得到了显著的改善，为扩大其应用范围提供了条件。高速剪切辅助处理可以加速限制性酶修饰反应，缩短反应时间，提高效率。

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Effect of High-speed Shearing Pretreatment on Limited Enzymatic Hydrolysis of Soy Protein Isolate

QI Lian-zi，CHI Yu-jie*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Provincial Key Laboratory of Soybean Biology,Education of Ministry, Harbin 150030, China)

TS253.1

A

1002-6630(2010)22-0011-05

2010-02-11

教育部博士点基金项目(20070224001)；黑龙江省自然科学重点基金项目(ZD200902)

齐莲子(1983—)，女，硕士研究生，研究方向为食品化学及农产品深加工。E-mail：qilianzi@139.com

*通信作者：迟玉杰(1963—)，女，教授，博士，研究方向为食品化学及农产品深加工。E-mail：yjchi@126.com