胆胃舒颗粒对豚鼠胆囊平滑肌 CCK-A受体的影响

郭莉芳 刘辉贤 邱锦芳 王天星 李 恺 郭绍举 李 健

保胆治疗胆囊结石的优点是既去结石又保留胆囊,保留了胆道系统结构和功能的完整性,但其最大的问题是如何防止胆囊结石的复发。为此,2009年 1～3月我们从动物实验入手,探讨胆胃舒颗粒预防胆囊结石复发的机制,现将方法和结果报道如下。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 动物 实验用 Hartley豚鼠 90只,由广东省实验动物中心提供。级别:普通级。体重:250～350 g。许可证号:scxx(粤)2003-0002。

1.1.2 主要试剂 (1)TRIZOL试剂,为美国 Technolo-gies公司产品。(2)逆转录试剂盒Access RT-PCRSystem为美国Promega公司生产。(3)豚鼠内参 β-actin引物:上游(625-649,24 bp):5'-ctg act gac tac ctc atg aag atc-3';下游(872-852,21 bp):5'-gga agg aag gct gga aga gtg-3'。PCR产物长度:248 bp。(4)豚鼠 CCK-A受体引物:上游(367-386,20 bp):5'-tca tcc cca atc tgc tca ag-3'。下游(658-639,20 bp):5'-cac ata ttc gcg gtc tgg tt-3';PCR产物长度:292 bp。

1.1.3 药品 胆胃舒颗粒为我院消化科经验方,由我院制剂室提供。组成:柴胡 15g,白芍 20 g,金钱草 15g,白术 15g,郁金 15 g,内金 15 g,黄芪 15 g,田七 5g,香附 15g,蒲公英 15g,海螵蛸 20 g,甘草 5g。

1.1.4 饲料 (1)标准豚鼠饲料。(2)胆固醇致石饲料。其中标准豚鼠饲料 95.45%,酪蛋白 1%,蔗糖 1.5%,猪油 1%,纤维素 1%,胆酸 0.02%,胆固醇 0.05%。酪蛋白由广东环凯微生物科技公司提供,批号:200703316;胆固醇由广州器化医疗设备有限公司提供,批号:080608;纤维素由广州器化医疗设备有限公司提供,批号:080403;胆酸为瑞士分装,批号:375217/227103。饲料均由广东省动物中心提供。许可证号:scxx(粤)2008-0009。

1.1.5 所需主要仪器 冻存管、液态氮罐。

1.1.6 其他 实验用的刀、剪、镊子及玻璃制品均 200℃高温 2 h烘烤处理。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将 90只豚鼠随机分为 3组,每组 30只。空白组:喂养普通饲料 40 g/只◦d-1;模型组:喂养胆固醇结石致石饲料 40 g/只◦d-1;治疗组:喂养胆固醇致石饲料 40 g/只◦d-1,并加用胆胃舒颗粒溶液 2ml灌胃。

1.2.2 处理 (1)实验 2个月后每组分为空腹组、餐后组两亚组,空腹组禁食 24h,在豚鼠眼眶处注射空气致死,剖开腹腔,用血管钳阻断胆囊管,取下胆囊,用注射器抽出胆汁以备检测。餐后组禁食 12 h后,给液体脂餐 15ml/kg体重灌胃,30min后剖腹取材,以备检测胆囊收缩功能。(2)胆囊平滑肌组织样本的提取与保存:完整取下胆囊,纵形剪开,收集胆汁沉积物,滤纸吸净;然后去掉黏膜及浆膜,保留平滑肌,最后将平滑肌组织装入冻存管并置入液氮罐中保存。

1.2.3 检测指标 (1)胆囊平滑肌中CCK-A受体数量测定按改良 UPP法及放射配基结合法(RBA)。将胆囊平滑肌置于 10ml预冷的匀浆缓冲液中(含蔗糖 250mmol/L,HEPES 10 mmol/L,大豆胰蛋白酶抑制剂 0.01%)充分剪碎,于电动中速匀浆器中匀浆(冰浴),每次 3min,共 3次。充分匀浆后,转移至干净离心管,2 500 r/min(4℃)离心 5min。收集上清液于干净离心管,收集沉淀于匀浆缓冲液,重新匀浆、离心,收集上清液。然后,合并两上清液,20 000 r/m in(4℃)离心 45 m in,收集沉淀,加入 HEPES缓冲液(含 HEPES 25 mmol/L,MgCl22.5mmol/L,NaCl 137mmol/L,NaH2PO40.7mmol/L,Glucose 10mmol/L,明胶 1%)摇匀,即为粗制膜受体。部分粗制膜受体以牛血清白蛋白为标准,用 Lowery法测定蛋白含量,其余用于配体结合反应。含膜蛋白 50μg的 HEPES缓冲液 300μl分别和不同浓度的 125I-BH-CCK-OP硫酸酯(1×10-11～1×10-9)反应,非特异性结合管另加入 1 000倍过量的未标记 CCK-OP硫酸酯。反应温度为 25℃,pH 6.5,时间 30m in,冰冷 HEPES缓冲液 900μl终止反应。离心法(4℃,4 500g,20min),收集沉淀,测定放射性计数,利用计算机获得 CCK-A受体的最大结合容量(数量)。(2)胆囊成石状况、胆囊收缩功能测定。胆囊成石情况判定:解剖胆囊,以肉眼观察胆囊内有无胆石或胆泥,若胆汁内存在成型、粗大颗粒者定性为结石,其成份用红外光谱分光光度计定性;胆囊收缩功能:剖腹后自然状态下测量胆囊最长长径(L),及相互垂直两横径(W,H),胆囊体积(v)=0.52×L×W×H(cm3),胆囊收缩功能 =(餐前体积-餐后体积)/餐前体积 ×100%。

1.3 统计学方法

将所得数据用 SPSS 10.0软件进行统计分析,计量资料采用 t检验,计数资料采用 Fisher确切概率法。

2 结 果

本研究共有 7只动物死亡(占总样本数的 5.6%),其中模型组中有 4只动物死亡,治疗组中有 3只动物死亡。

2.1 各组动物胆结石发生情况

以肉眼所见棕黑色泥沙样结石及絮状沉淀物作红外光谱鉴定为胆固醇结石作为成石标准:模型组成石率为 92.30%,治疗组成石率为 14.81%,显著低于模型组(P＜0.05)。见表 1。

表1 各组动物成石率比较 例

2.2 各组豚鼠胆囊收缩功能比较(表 2)

表2 各组胆囊收缩功能比较±s,%)

表2 各组胆囊收缩功能比较±s,%)

注:与模型组比较,△P＜0.01,*P＜0.05

组别 例数 胆囊收缩率空白组 30 68.63±5.79△模型组 26 41.16±4.79治疗组 27 65.25±6.24*

2.3 各组 CCK-A受体比较(表 3)

表3 各组胆囊组织 CCK-A受体的变化 (±s,fmol/mg pro)

表3 各组胆囊组织 CCK-A受体的变化 (±s,fmol/mg pro)

注:与模型组比较,△P＜0.01,*P＜0.05

组别 例数 最大结合容量空白组 30 62±15△模型组 26 30±11治疗组 27 58±12*

3 讨 论

胆囊结石是临床常见病,据中华外科学会胆道学组 1995年底公布的调查报告,胆囊结石几乎占胆石病的 80%[1]。中医认为肝失疏泄,胆汁排泄不畅,淤滞日久,聚而成石。故各种病理因素导致胆气不舒是胆囊结石的基本病机。我们科室长期采用内镜微创保胆取石术(MC)方式,术后配合胆胃舒颗粒,预防结石复发[2]。

胆胃舒颗粒专为胆结石术后防止结石复发设计,方中金钱草、柴胡、郁金、香附等利胆、疏肝、止痛;黄芪、白术、海螵蛸等健脾、益气、和胃;田七、鸡内金、郁金等活血、化瘀、散结;蒲公英、金钱草等清热、化湿;白芍、甘草缓急止痛。能促进消化系统功能,增强体质,明显促进胆汁分泌、代谢及排泄,增强胆囊的收缩功能,排出胆囊内淤积及有形微粒,从而有效防止胆囊结石的复发。

本研究显示,模型组的胆囊收缩功能明显低于治疗组,而CCK-A受体较治疗组降低,说明CCK-A受体与胆囊收缩功能呈正相关,这在基因水平上支持 CCK受体在胆囊结石形成中的重要作用,同时也说明CCK受体数目减少有其分子病理基础,此结果与陈胜报道结果相一致[3];同时,胆囊结石患者胆囊收缩功能下降与CCK-A受体下降相关,郑培永等[4]研究表明:病人胆囊组织中 CCK-A受体有降低的趋势。以上表明 CCK-A受体在胆囊运动调节中起重要作用,同时提示CCK-A受体减弱是胆石病患者胆囊收缩功能减弱的重要原因:CCK-A受体下调,蛋白质合成减少,从而胆囊对CCK敏感性降低,胆囊收缩减弱。主要表现为胆汁淤积,胆固醇结晶析出,进而形成结石。

本研究还发现,治疗组的结石率明显低于模型组,而且胆囊收缩功能、CCK-A受体最大结合容量均优于模型组,保证了胆囊收缩功能,防止胆囊结石的发生。至于利胆健脾法为主中药调节胆囊平滑肌CCK-A受体的作用机制,可能有上调胆囊平滑肌CCK-A受体增加CCK与 CCK-A受体的亲和力、降低胆汁中胆固醇的浓度、减轻其对胆囊平滑肌细胞膜的伤害、促进胆汁的肠肝循环的作用,详细机制尚需进一步的研究。

[1] 中华外科学会胆道外科学组.我国胆石病十年来的变迁[J].中华外科杂志,1995,33(11):652-658.

[2] 李 健,杨卓欣,黄明河,等.微创保胆内镜取石术加防石胶囊治疗胆囊结石的初步观察[J].中国中医药科技,2003,10(1):50-51.

[3] 陈 胜,韩天权,蒋 渝,等.胆囊结石患者胆囊动力学紊乱机制的研究[J].中华外科杂志,1998,36(1):14.

[4] 郑培永,章学林,朱培庭,等.胆囊结石病肝气郁结证与 CCKAR和VIPR基因表达的相关性研究[J].中国中西医结合外科杂志,2004,10(5):346-348.