平白术多糖的分离纯化及IR、GC分析

谭 敏，邱细敏★，陆艳艳，陈 文，曾 明，于业芳

（1湖南师范大学医学院药学系，湖南 长沙 410006；2长沙医学院，湖南 长沙 410000）

中药白术为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz)的干燥根茎，性温，味甘、苦，归脾、胃经,具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎等作用[1]。主产于浙江、安徽、湖南、湖北、江西等地[2]。近年来，白术多糖的增强免疫功能，抗氧化，降血糖等作用越来越受到关注，其独特的功能，有望成为一种极具开发潜力和开发价值的保健品和药品[3-6]。多糖所具有的药理活性往往与其结构是密切相关，因此对于具有药理活性的多糖进行结构方面的深人研究显得越来越重要[7]。本文对湖南平江白术多糖进行分离纯化，并对其进行组成分析，为进一步弄清结构与功能的关系提供试验资料，也为充分利用和发展湖南平江白术具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白术药材（购置湖南平江，由湖南师范大学药学系生药学教研室鉴定为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz)的干燥根茎）；DEAE-纤维素（国药集团化学试剂有限公司）；甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、半乳糖（国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪GC4000A series（北京东西分析仪器有限公司）；HGT-300E氮、氢、空气发生器（北京汇龙公司）；OV-101毛细管柱（30m×0.53×0.5μm）；NICOLET 5700傅里叶红外光谱仪 （Perkin Elmer公司）；电子分析天平（AUY 120,SHIMADZU）；冷冻干燥机 （北京博医康实验仪器有限公司）；RE-85Z旋转蒸发仪 （巩义市英峪予华仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

1.3 多糖的分离与纯化

1.3.1 平白术多糖的提取与纯化[8]

精密称取平白术粗粉50 g,100℃水提2 h,滤渣反复提取三次，合并水提液,浓缩。浓缩液用乙醇、丙酮反复洗三次,沉淀冷冻干燥，即得平白术粗多糖（CAMP）。取CAMP适量用蒸馏水溶解，加三氯乙酸至10%，搅拌30 min静置过夜。离心，取上清液，重复多次，直至在260-280 nm范围内无吸收。加入30%过氧化氢至1%，脱色3～4 h，NaOH调节pH至8～9，抽滤浓缩，冷冻干燥，得纯化平白术精多糖（RAMP）。

1.3.2 平白术多糖的精制

取RAMP溶于少量蒸馏水中，DEAE-纤维素色谱柱进行分离,分别用蒸馏水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl洗脱，流速 1ml/ min，每10分钟收集一管，隔管用蒽酮-硫酸法[9]测定吸光度值,收集各洗脱液。

1.4 组成研究

1.4.1 红外光谱测定[10]

将光谱纯KBr在160℃烘干6 h，贮于干燥器中备用。采用KBr压片法，取RAMP 2 mg，KBr 150 mg，用研钵研磨细，KBr空白片作参比，在4000～400cm-1区间扫描。

1.4.2 气相色谱分析

1.4.2.1 标准单糖衍生化[11]精密称取10 mg标准单糖于试管中,加入10 mg盐酸羟胺，加入0.5 mL吡啶,振荡混匀,加入90℃水浴中加热反应。取出后冷却至室温,加入0.5 mL醋酸酐,在90℃下继续反应进行乙酰化。按照上述方法,取标准单糖混合物0.1μL进行气相色谱分析。

1.4.2.2 RAMP水解和衍生化

精密称取15 mgRAMP,加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液,振荡,将溶液转移到安瓶中,充N2后封口,置于100℃加热水解4 h。取出置于60℃水浴中吹干。将水解后的RAMP按照标准单糖衍生化的方法,将其衍生化,取样1μL进行气相色谱分析。

1.4.2.3 气相色谱分析条件

升温程序:初始柱温130℃,以2℃/min的升温速率升至150℃,以3℃/min升至210℃,维持20 min；N2流速为 10 mL/min,H2流速为20 mL/ min,空气流速为300 mL/min,进样温度为130℃，柱温为250℃，检测器温度为280℃。

2 结果

2.1 平白术多糖的纯化结果

RAMP经DEAE-纤维素柱分离纯化后得到3个主要洗脱峰RAMP-1,RAMP-2,RAMP-3,其中蒸馏水洗脱组分所占比例最大，为平白术多糖的主要组分。

2.2 RAMP的纯度鉴定

将RAMP在200～700 nm紫外扫描，260～280 nm无明显的吸收峰,紫外谱图显示样品中无蛋白质、核酸。

2.3 结构分析

2.3.1 RMAP的红外光谱图[10，12]

图1 RMAP的红外光谱图

从图1可见，红外光谱图在3378cm-1为糖OH伸缩震动的强吸收峰，且存在分子间氢键。2928 cm-1为C-H伸缩振动，1645 cm-1的吸收为少量羰基的吸收峰，1460～1350 cm-1处的吸收峰为-OH的变形振动，表明该组分为多聚糖，含末端甲基类单糖。1429.3 cm-1处的吸收峰是C-H的变角震动，是糖环的特征吸收，1031 cm-1为C-O键的伸缩振动，988.8 cm-1处的吸收峰是脱氧糖的次甲基的横摇振动引起，937.1 cm-1是呋喃环的对称伸缩振动所造成的，875.1 cm-1是吡喃糖β-型C-H的变角振动的特征吸收峰，819.0 cm-1是呋喃环的C-H变角振动。1644.5、1141.5、1194.8、1337.2、1031 cm-1处的吸收峰说明该多糖含糖醛酸这些吸收均为糖的特征吸收位置。

2.3.2 单糖的组成分析

图2 ：RAMP的气相色谱图

图3.混合标准对照品的气相色谱图

根据单糖对照品和样品的色谱保留时间,将RAMP水解产物的糖睛乙酰酯衍生物的气相色谱图(图2)与混合单糖对照品的气相色谱图(图3)对照比较，同时在样品的混合单糖衍生物的色谱峰中逐一加人标准单糖衍生物,从混合单糖色谱峰面积变化,鉴定出相应单糖峰,结果可知RAMP单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。

3 讨论

多糖水解是试验过程关键的一步，可采用硫酸、三氟乙酸等方法。但高浓度的硫酸易造成多糖的碳化，使图谱复杂化，而低浓度的硫酸水解不完全，分析灵敏度降低，故采用三氟乙酸水解。试验中比较2mol/L，4mol/L三氟乙酸的水解效果，发现2 mol/L三氟乙酸法水解平白术多糖气相色谱的响应值较高。

糖腈乙酸酯衍生化气相色谱法可得到单糖的单一色谱峰,能用于单糖组分分析，对未知结构多糖的分析十分重要。本实验得到的白术多糖的单糖组成与文献报道的不完全一致[13]，可能是因为产地不同。有关平白术多糖的组成与生物活性之间的关系,有待进一步深入研究。

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