血水草生物碱对钉螺足跖平滑肌mAChR的作用

廖鑫鑫，黄 胜，杨华中，黄琼瑶，彭 飞，刘年猛，孙 慧

（1.湖南师范大学医学院05级医疗专业学生；2.湖南师范大学医学院药理学教研室；3.湖南师范大学医学院寄生虫学教研室，湖南 长沙 410006）

血水草（Eomecon chionantha Hance）系罂粟科植物血水草属[1]。从其根茎中提取的ECA，在研究杀螺植物时，发现有杀灭钉螺、降低钉螺附壁上爬率的作用[2-4]。有文献报道[7]，乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)是湖北钉螺足跖平滑肌的兴奋性递质，在钉螺的足部肌肉中存在胆碱能受体 (acetylcholine receptors,AChR)。为阐明ECA的作用机制，本实验采用离体钉螺足跖平滑肌标本，探讨ECA对其收缩的影响及与mAChR的关系，为进一步研究和开发该药提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 钉螺

湖北钉螺（Oncomelania hupensis）为试验前2～3天从岳阳君山采集置实验室饲养。选取成熟 （螺龄7～8旋）、活动能力强的钉螺进行试验，雌雄兼用。

1.2 药品

ECA由本实验室提取制备[5]。临用时，用Ringer's液溶解、稀释成所需浓度。Ringer's液的组成（mmol/ L）：NaCl 115.60，KCl 1.20，CaCl21.05，NaHCO32.68，NaH2PO40.054。用双蒸水配制，PH 7.6。Atropine sulphate，Sigma公司产品。不同浓度的实验药物均采用等容量给药法，0.1mL/次，加在10mL标本槽内。

1.3 仪器

BL-420E+生物信号采集处理系统(成都泰盟)、微张力换能器（10g，JH-2A，航天医学工程研究所)、双目解剖显微镜（ASOM-4，成都科奥）。

1.4 离体钉螺足跖平滑肌的制备

取健康钉螺1只，按李氏破螺法破螺[6]，将钉螺置于通入混合气体（95%O2+5%CO2）的Ringer's液的培养皿中，在双目解剖显微镜下分离足跖平滑肌，用自制的两个不锈钢小钩分别固定足跖平滑肌前、后处，其中通过一小钩端固定在标本板上，移入盛有10mL Ringer's液的恒温浴槽中，持续通入混合气体，温度20～25℃；另一个小钩端通过连线与张力传感器相连，用BL-420E+生物信号采集处理系统实时记录试验全过程，观察和记录足跖平滑肌的张力、收缩幅度及频率的变化情况。

1.5 ECA对离体钉螺足跖平滑肌的自发性收缩的影响实验

实验设计为用药（ECA）前后的对比，用药前给予与实验组等量的Ringer's液作对照，实验组设3个浓度（5.0mg、10.0mg、20.0 mg/L ECA）。实验前，预先给浴槽中的足跖平滑肌标本500mg负荷，平衡1.5h，平衡期间不断调整其静息张力，使基线处在一个稳定的状态，每隔15min更换一次营养液，基线稳定后开始实验。记录一段正常曲线后，再用微量注射器抽取对应浓度的药物（0.1mL/次）加入浴槽中，然后观察注入药物后足跖平滑肌的张力收缩幅度及频率的情况。各标本在进行下步实验前，需用Ringer's液冲洗5次，使曲线回到基线后，平衡30分钟，待其恢复正常，才能进行下步操作。每组10个标本。

1.6 ECA对钉螺足跖平滑肌

mAChR的影响实验 实验条件同前。记录一段正常的曲线后，加入20.0 mg/L ECA，记录收缩曲线。冲洗、平衡，待曲线恢复正常并稳定后进行阿托品的干预实验：加入2×10－6mol/L或6×10－6mol/L阿托品，5min后再加入20.0 mg/L ECA，记录收缩曲线。共测试10例标本。

1.7 统计学处理

实验结果以mean±s表示，组间差异用t检验。

2 结果

2.1 ECA对钉螺足跖平滑肌自发性收缩活动的影响

3种浓度的ECA均能使钉螺足跖平滑肌收缩曲线的基线上移，肌张力增加；收缩幅度减小，收缩频率加快。且呈现明显的量效关系（见表1）。

2.2 ECA对钉螺足跖平滑肌mAChR的影响

2×106阿托品可明显地降低由ECA所至的钉螺足跖平滑肌张力，但不能有效影响其收缩幅度及收缩频率；6×10-6mol/L阿托品明显地抑制由ECA所至的钉螺足跖平滑肌张力及收缩幅度，而对收缩频率仍无显著影响（见表2）。

表1 ECA对钉螺足跖平滑肌自发性收缩的影响（mean±S，n=10）

表2 血水草生物碱对钉螺足跖平滑肌mAChR的影响（mean±S，n=10）

3 讨论

根据对钉螺足跖肌形态学的研究，其足跖肌属于平滑肌[6]。其上存在AChR，ACh是其兴奋性递质[7]。AChR兴奋可致平滑肌细胞跨膜Ca2+移动的增加，细胞内Ca2+增加，引起肌肉收缩[8]。AchR有mAChR和烟碱型乙酰胆碱受体 (nicotinic acetylcholinereceptors，nAChR)二类。平滑肌细胞上主要为mAChR。刺激mAChR-M3能有效地排尽内质网中Ca2+库，迅速引起细胞质内Ca2+浓度提高；同时引起Ca2+跨过细胞膜内流，而导致平滑肌收缩[9]。先前的实验证实，ECA对钉螺足跖平滑肌的兴奋作用与ECA促外Ca2+内流和促内Ca2+释放有关[10]。本实验采用离体试验方法，探讨ECA兴奋钉螺足跖平滑肌作用是否与mAChR介导有关，结果表明：ECA能显著地使钉螺足跖平滑肌张力增加、收缩幅度减小，收缩频率加快，且有明显的量效关系，此结果与以往报道一致[10]；小剂量阿托品（2×10-6mol/L）可明显地降低由ECA所至的钉螺足跖平滑肌张力，但不能有效影响其收缩幅度及收缩频率；大剂量阿托品（6×10-6mol/L）既能明显地抑制ECA所致的钉螺足跖平滑肌张力，也能有效地降低其收缩幅度，但对其收缩频率仍无显著影响。阿托品为mAChR的阻断剂，可选择性的阻断mAChR激动剂对该受体的激动作用，从而使该受体的生物效应或药理效应降低。从上述实验结果来看，大、小剂量的阿托品，均能拮抗ECA兴奋钉螺足跖平滑肌作用，提示ECA的此种兴奋作用与mAChR介导有关；钉螺足跖平滑肌上存在mAChR。至于不同的剂量的阿托品对ECA拮抗作用的差异，本人认为主要是由于mAChR阻断剂阿托品的量效关系所致。小剂量的阿托品对mAChR的阻断不完全，而大剂量阿托品阻断作用较完全。值得注意的是：大、小剂量的阿托品均对ECA所致的收缩的频率无明显影响，这可能是由于ECA兴奋平滑肌作用与多种因素介导有关，而非仅由mAChR介导所致。

综上分析，钉螺足跖平滑肌上存在有mAChR；ECA兴奋钉螺足跖平滑肌，导致其紧张性收缩或痉挛性麻痹的作用部分是由mAChR介导的，并可能通过激活ROCC，促外Ca2+内流和促内Ca2+释放引起。

[1]吴征镒.新华本草纲要[M].上海：上海科学技术出版社, 1988.238.

[2]刘年猛,彭飞,黄琼瑶,等.血水草生物碱灭钉螺的初步探讨[J].中国血吸虫病防治杂志，2001，13(5):303-304.

[3]黄琼瑶，彭飞,刘年猛，等.血水草生物碱杀灭钉螺的研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2004,16(1):55-57.

[4]彭飞，黄琼瑶，刘年猛,等.血水草生物碱实验室和现场杀灭钉螺的效果观察[J].中国热带医学,2003,3(4):435-437.

[5]杨华中,黄琼瑶,刘年猛,等.血水草杀螺成分-血水草生物碱((ECA)的提取[J].中国血吸虫病防治杂志,2003,5(6):450-451.

[6]李赋京.钉螺解剖与比较解剖[M].武汉:湖北人民出版社[M].1956.1-44.

[7]耿辉,夏国瑾,何昌浩.槟榔碱对湖北钉螺足肌胆碱能受体的作用[J].中国血吸虫病防治杂志,1999.11(5):281.

[8]Cardenes HL,Ross DH.Calcium depletion of synaptosomes after morphine treatment,Br J Pharmacology,1976，57(4): 521-526.

[9]Berridge MJ,Irvine RF.Inositol.phosphates and cell signalling[J].Nature，1989,341(6239):197-205.

[10]杨华中，彭飞，刘年猛，等.血水草生物碱对离体钉螺足跖平滑肌收缩的影响及与Ca2+的关系[J].中国血吸虫病防治杂志,2005.17(6):427-429.