7－二氟亚甲基－5，4，－二甲烷氧基异黄酮对动脉粥样硬化兔血管内皮功能的影响

游计良，赵 红，谭锦盛，邢小伟，符晓华★

（湖南师范大学医学院心血管病研究室，湖南 长沙 410006）

血管内皮细胞受损和功能改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis AS)发生发展的始动环节[1]。一氧化氮（NO）的生成减少是血管内皮功能受损的关键性特征[2]，内皮素（ET-1）水平的升高也在一定水平上反映了内皮细胞受损程度。乙酰胆碱（Ach）可以刺激血管内皮细胞合成NO并被广泛用于评估内皮依赖性血管舒张功能的检测。

金雀异黄素是一种植物雌激素，化学名为5，7，4'-三羟基异黄酮，具有抗AS作用[3-4]，但其在肠道吸收甚少[5]而影响其疗效。dFMG是本课题组以金雀异黄素为先导物设计合成的新型衍生物。体外研究发现dFMG具有血管内皮保护作用，其作用是先导化合物金雀异黄素的100倍[6]。体内研究显示dFMG具有防止血管内膜过度增生及抗AS的作用[7]；他汀类是目前临床应用最广的降血脂和抗AS药物；本研究建立高脂饮食兔AS模型，以洛伐他汀作为阳性药物对照，检测药物作用前后内皮受损指标NO、ET-1水平以及兔离体血管环对乙酰胆碱(Ach)诱导的血管内皮依赖性舒张功能变化，旨在进一步探讨dFMG在体内的血管保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品试剂 7-二氟亚甲基-5,4'-二甲烷氧基异黄酮（湖南师范大学药学系参照文献［6］中的方法合成，纯度＞99%，分子式C18H14O5F2，分子量348，性状为淡黄色晶体粉末）；金雀异黄素（美国Sigma公司）；洛伐他汀（扬子江药业集团有限公司生产，生产批号07061201）；胆固醇（长沙迪博制药有限公司）；马血清（上海天呈生物制品有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Amresco公司）；NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ET-1酶联免疫试剂盒(上海天呈生物制品有限公司)；标准化学对照品:苯氧肾上腺素(上海顺勃生物制品有限公司)，氯化乙酰胆碱 （上海顺勃生物制品有限公司）；戊巴比妥钠（美国Sigma公司）；吲哚美辛（辽宁康博士制药有限公司）；NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、K2HPO4、NaHCO3和葡萄糖为分析纯（长沙欧迈生物制品有限公司）。

1.1.2 仪器 高速冷冻离心机，由美国Sigma公司生产；恒温水浴箱，由中国杭州蓝天仪器厂生产；Eppendorf加样器，由德国Eppendorf公司生产；680型全自动酶标仪，由美国BIO-RAD伯乐生产；电子天平，由上海天平仪器厂生产；RM6240系列生理信号采集处理系统及肌张力换能器，由成都仪器厂生产。

1.1.3 实验动物 雄性新西兰兔40只，体重2.0～2.5kg，3～4月龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物合格证号SCXK(沪)2007-0005。

1.2 方法

1.2.1 AS模型兔制备 40只雄性新西兰兔随机抽取32只制作AS模型，剩余8只喂普通饲料作为正常对照组。造模方法为高脂饮食结合免疫损伤制作AS模型：造模初从耳缘静脉注射马血清5mL/kg，免疫损伤一次，继以高脂饮食 （89%普通兔饲料中加胆固醇1.0%，蛋黄粉10%）100g/天定量喂养60天。

1.2.2 AS模型兔的分组 造模60天时耳缘静脉采血5 mL测定血脂，根据此时总胆固醇水平，用随机区组法将AS高脂模型兔分为4组：模型对照组、dFMGEN组、洛伐他汀组、金雀异黄素组。dFMG组、洛伐他汀组、金雀异黄素组分别以dFMG、洛伐他汀、金雀异黄素5 mg/kg溶于含0.01%DMSO的生理盐水灌胃给药，每天1次，共30天。模型对照组则以等量含0.01%DMSO的生理盐水灌胃给药，每天1次，共30天。在治疗前后分别于兔耳缘静脉取血5mL，室温下300g离心15 min，取血清-20℃冰箱冻存，用于检测血清NO，ET浓度。

1.2.3 血清学指标浓度检测 NO(硝酸还原法, μmol/L为单位,试剂盒购自南京建成生物工程研究所)。ET-1（酶联免疫法，pg/mL为单位，试剂盒购自上海天呈生物制品有限公司）。以上检测方法均参照试剂盒说明操作。

1.2.4 乙酰胆碱(Ach)诱导的血管内皮依赖性舒张功能的影响

1.2.4.1 实验溶液的配制 离体血管环实验当天，称取NaCl 6.9135g、KCl 0.3496g、CaCl20.2076g、MgSO40.2958g、K2HPO40.2351g、NaHCO32.1003g和葡萄糖 2.1997g，溶解于双蒸水中，调pH至7.40，配成1000mL Krebs液；称取3.5779mg吲哚美辛加入到1000mL Krebs液中，充分溶解，得到10μmol/L的吲哚美辛溶液；称取2.0000g戊巴比妥钠溶于200mL生理盐水中，配成1%戊巴比妥钠生理盐水溶液用于麻醉动物；将10mg苯氧肾上腺素（PE）溶解于98.830mL双蒸水中先配成0.3mmoL/L的PE溶液，用时吸取5μL0.3mmol/L的PE加入到10mL的恒温水浴槽中使其工作浓度为0.15μmol/L；将1g氯化乙酰胆碱（Ach）加双蒸水5.5mL配成1mol/L的母液，避光保存。吸取20μL的1mol/L的Ach母液，加双蒸水稀释至1mL,用时吸取5μL加入到10mL的恒温水浴槽中即可使其工作浓度为10-5Ach。吸取20μL的10-5Ach稀释至200μL，用时吸取5μL加入到10mL的恒温水浴槽中即可使其工作浓度为10-6Ach。依次类推，下一个浓度Ach由上一个浓度Ach稀释10倍。除母液可保留两天外，稀释工作液均用时临时配制，避光保存。

1.2.4.2 离体血管环实验 治疗给药30天后，耳缘静脉注射戊巴比妥钠30～35mg/kg麻醉兔，颈总动脉快速放血处死，然后迅速分离胸主动脉中段，置于冰浴的Krebs液 (mmol/L):NaCl 118.3、KCl 4.69、CaCl21.87、MgSO41.20、K2HPO41.03、NaHCO325、葡萄糖 11.1(pH 7.40)中，小心去除血管外膜的结缔组织，制作过程中不能损伤血管内皮，将其横切为 3 mm长的血管环。将血管环垂直置于10 mL的恒温水浴槽中，一端与小钩相连，另一端挂于张力换能器的小钩上。保持 Krebs液温度为37℃并通入95%O2和5%CO2的混合气。实验中恒温水浴槽中加入10μmol/L的吲哚美辛以抑制前列环素的生成。实验时给胸主动脉环施以2 g的前负荷，平衡60 min后开始实验，加入0.15μmol/L苯氧肾上腺素（PE）预收缩血管，待血管收缩达到平台后，加入浓度累计增加的Ach舒张血管。血管环对不同浓度Ach的舒张反应以其占 0.15μmol/L PE引起的收缩幅度的百分比计算。

1.2.5 统计方法 所有实验计量资料以均数±标准差表示。数据分析使用SPSS11.5统计软件。多个样本均数采用单因素方差分析（ANOVA）,两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 dFMGEN对血清NO和ET-1的影响

造模60天后各组高脂模型兔体内NO水平显著降低，ET-1水平显著升高，与Normal组比较有显著统计学意义（P＜0.01）。治疗30天后各组兔体内NO水平均有升高，与Model组比较,GEN组（P＜0.05）；Lovastatin组 （P＜0.01）；dFMG组 （P＜0.01）；GEN组与Lovastatin组和dFMG组比有统计学意义（P＜0.01）；Lovastatin组和dFMG组相比无统计学意义（P＞0.05）。各组兔体内ET-1水平治疗30天后较前下降，与Model组比较，GEN组（P＜0.01）；Lovastatin组（P＜0.01）；dFMG（P＜0.01）；GEN组与Lovastatin组和dFMG组比有统计学意义（P＜0.05）；Lovastatin组和dFMG组相比无统计学意义 （P＞0.05）。见表1。

2.2 dFMG对Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能的影响

乙酰胆碱 (Ach)呈浓度依赖性的舒张各组血管。但Model组对Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能明显减弱；在10-5Ach作用下，Model组舒张度为53.5%±1.8%，比Normal组舒张度89.5%± 1.6%明显减弱（P＜0.01）。Lovastatin和dFMG均能显著改善Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能（P＜0.01），在10-5Ach作用下的舒张度分别比Mod-el组增加32%和41%，Lovastatin和dFMG两组间比较无统计学意义（P=0.082）。GEN也能部分改善Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能（P＜0.05），在10-5Ach作用下的舒张度比 Model组增加 9%；dFMG在10-5Ach作用下的舒张度比GEN的舒张血管功能改善25%，GEN和dFMG比较有统计学意义（P＜0.01）。如图2-2所示。

表1 dFMG对兔血清中NO、ET-1水平的影响

3 讨论

图2-2 dFMGEN对Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能的影响

NO是体内最重要的舒血管因子[8]，主要由血管内皮细胞中的一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸的胍基氮氧化生成，具有松弛平滑肌、扩张血管、减少脂质浸润，消除氧自由基，抑制炎症反应等作用，预防AS的发生，并对不同发展阶段的AS的病理形成有改善和逆转作用[9]。ET-1是体内最强的缩血管物质，ET-1增多时引起血管内皮功能紊乱，单核细胞趋化作用增强，血小板间粘附聚集增多，血管平滑肌细胞增生繁殖，促进AS的形成[10]。正常生理状态下，NO和ET-1间保持相互平衡。在长期高脂饮食作用下，动脉内皮细胞和平滑肌细胞过度表达ET-mRNA，释放大量ET-1，NOS翻译障碍，NOS表达密度下调，NO生成减少，NO和ET-1间平衡打乱，最终使内皮功能受损，导致AS发生。金雀异黄素是一种植物雌激素，能够改善内皮依赖性血管舒张反应[11]，直接增强人血管内皮细胞内NOS基因转录和蛋白合成，导致NO的产生[11]，并且在生理浓度下可以抑制ET-1mRNA表达，减少ET-1蛋白的分泌。本研究发现治疗30天后dFMG组血浆中ET-1水平显著降低，NO水平显著升高，与金雀异黄素组相比有统计学差异，说明dFMG较其先导物金雀异黄素具有更强的血管内皮细胞保护作用，能更好地抗AS。

乙酰胆碱 （acetylcholine,ACh）是一种神经递质，能特异性的作用于各类胆碱受体。它可以通过激动一氧化氮合成酶(NOS)来调节NO的合成与释放。本研究中乙酰胆碱(Ach)呈浓度依赖性的舒张各组血管，GEN能部分改善Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能，而dFMG能显著改善Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能，其作用与Lovastatin相同。这提示dFMG比其先导物GEN能够更好的改善Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能。结合目前研究，我们发现dFMG可以影响NO和ET-1的释放，改善Ach诱导的血管内皮依赖性舒张功能；但其对血管内皮保护作用的具体机制，我们正在做进一步的研究和探讨。

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