粉防己碱对人翼状胬肉成纤维细胞体外增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

孙广莉,张明昌,蒋 丽

郑州大学第一附属医院眼科郑州 450052

△女,1977年5月生,博士,主治医师,研究方向:眼表疾病,E-mail:sunguangli1@126.com

翼状胬肉是局部球结膜纤维血管组织增生侵犯角膜的一种疾病,是临床上最常见的眼病之一,不仅可引起眼刺激征、外观缺陷,还可不同程度地影响视力,但其发病机制仍不十分清楚。治疗翼状胬肉的手术方法较多,但均有一定的复发率,治疗效果仍不满意,因此寻找有效、不良反应少的治疗方法是当前研究的热点。作者观察了粉防己碱(tetrandrine, Tet)对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(human pterygium fibrob last,HPF)的抑制作用,以寻找辅助治疗翼状胬肉的新方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Tet由浙江金华制药厂生产(粉剂,纯度＞98%),2.5 g/L胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)、RNA酶及EDTA Hank's液由华中科技大学同济医学院提供,噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司, DMEM培养基及新生牛血清购自Gibco公司,小鼠抗人角蛋白、波形蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体为武汉博士德公司产品。

1.2 Tet储存液的配制 以少量DMSO助溶,加入DMEM配制成10mmol/L的贮存液,分装,-20℃避光保存,2周内有效。使用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。

1.3 HPF的培养、鉴定与传代 胬肉组织标本为郑州大学第一附属医院眼科手术切除新鲜组织,采用组织块培养法原代接种 1 d后,观察组织块贴壁情况、培养液色泽、细胞生长状况和形态特征等。48 h后观察有细胞从组织块周围爬出,每 3～4 d更换1次培养液,待细胞生长汇合至 80%后以 2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞,按 1:3分种传代。取传代细胞接种于预置盖玻片的 6孔板,待细胞长满盖玻片,取出用无水乙醇+冷丙酮(体积比1:1)混合固定15 min,风干后 HE染色,并以抗波形蛋白和角蛋白抗体行免疫细胞化学鉴定。

1.4 Tet对HPF增殖的影响 采用MTT比色法。HPF细胞用含体积分数 10%的新生牛血清、100 kU/L青霉素及100 kU/L链霉素的DMEM培养基,于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养,2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取对数生长期HPF细胞按1× 105mL-1接种于 96孔培养板,每孔加液 200μL。设不接种细胞的空白组(调零组)、对照组和Tet组。24 h后换液,对照组不加Tet,Tet组Tet终浓度分别为 20、40、80和160μmol/L。每个浓度每个时间点设6个复孔。分别于Tet干预24、48及72 h后加入5 g/LMTT 20μL,继续培养4 h后吸出培养液,每孔加二甲基亚砜150μL,振荡溶解10 min,待结晶完全溶解后,在ELX 800酶标仪上选择波长490 nm,空白组调零,测定各孔吸光度(A)值,计算细胞生长抑制率:抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.5 Tet对HPF细胞PCNA表达的影响 采用免疫细胞化学法。取对数生长期 HPF细胞,1×105mL-1接种于预置盖玻片的 6孔板,24 h后换液,对照组不加Tet,Tet组Tet终浓度分别为20、40、80和160μmol/L,培养48 h后0.01 mmol/L PBS冲洗3次,冷丙酮+无水乙醇(体积比1:1)固定。采用SP法,操作按说明书进行,鼠抗PCNA单克隆抗体稀释度为1:50。胞核呈棕黄色为PCNA阳性。200倍镜下计数 100个细胞中的阳性细胞数,计算阳性细胞百分率,即PCNA阳性表达率。

1.6 统计学处理 采用SPSS 11.0对HPF的生长抑制率和PCNA阳性表达率行单因素方差分析及SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HPF培养、鉴定结果 采用组织块培养法原代接种 48 h后观察到有细胞从组织块周围爬出,组织片的边缘可见“毛刷状”缘,细胞呈火焰状或放射状延展,轮廓清晰,胞体透亮(图1A)。待细胞长满盖玻片,固定风干后行 HE染色,可见细胞轮廓清晰,呈扁平多边状的上皮形态,胞质内为淡红色,胞核边界清晰,有的可见“双核”(图1B)。SP法染色鉴定细胞,见波形蛋白表达阳性,位于胞质,呈现与HPF长轴方向一致棕黄色束状或网状结构(图1C),细胞阳性表达显示为棕黄色、黄色或浅黄色细小均匀颗粒,分布于整个细胞核。

图1 HPF细胞鉴定结果A:HPF原代细胞(×40);B:HPF传代细胞(HE,×200);C:HPF波形蛋白染色(SP,×200)。

2.2 Tet作用后HPF的生长抑制率 结果见表1。对照组细胞呈铺路石样、排列整齐贴壁生长;Tet组细胞变圆、分布松散,且细胞数减少。

表1 Tet作用后HPF的生长抑制率 %

2.3 Tet对HPF细胞PCNA表达的影响 结果见图 2、表 2。

图2 Tet组HPF细胞PCNA的表达(SP,×200)

表2 不同浓度Tet作用48 h对HPF PCNA表达的影响

3 讨论

翼状胬肉是眼科的常见病之一,病理学研究[1]表明,它的主要成分是异常增生的成纤维细胞和新生血管,具有类似肿瘤发生前的性质。纤维增生和新生血管化的范围和程度是预测翼状胬肉切除术后复发的可靠形态学指标[2]。作者直接从人翼状胬肉组织培养细胞,其生物学特性基本和人眼病变的翼状胬肉情况相符合。进一步采用免疫细胞化学法对细胞鉴定,其波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性。结合组织来源和细胞生长特性可以确认为HPF细胞。

Tet是从中药防己、粉防己或千金藤中分离出来的一种生物碱,为双苄基异喹衍生物,具有消炎、镇痛、解热、抗过敏、抗自由基及抗癌等多种药理作用,还具有抑制成纤维细胞增殖及胶原合成作用[3]。有研究[4]发现,Tet在5μmol/L以上浓度能明显抑制体外培养的人瘢痕 HPF细胞增殖和胶原合成, Tet的抗瘢痕作用可能通过直接抑制HPF细胞DNA合成、调控其胶原代谢以及对细胞因子的间接作用等方面来完成[5]。

作者采用不同浓度Tet干预人翼状胬肉HPF细胞后发现,Tet可抑制人翼状胬肉HPF细胞生长,随着干预浓度的增大和时间延长,抑制率增加;而且降低PCNA阳性表达率。PCNA是一种核内蛋白,是DNA复制时D聚合酶的辅酶,直接参与核内DNA的合成,主要表达在细胞增生周期的 S期,与细胞增殖活动密切相关,可作为一种准确、简便且直观研究细胞增殖状况的指标[6]。作者发现当 Tet的浓度≥20μmol/L时能抑制细胞PCNA的表达,这与采用MTT法检测的Tet对细胞增殖活性具有抑制作用的结果相一致。该研究结果表明Tet能抑制HPF增生,提示 Tet对翼状胬肉的治疗具有潜在的应用前景。总之,该研究为寻找翼状胬肉新的辅助治疗方法提供了一条思路,但目前研究仅限于离体实验,且Tet发挥作用机制较为复杂,有待进一步研究。

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[3]徐永红,边城,李定国,等.汉防己甲素对成纤维细胞增殖及胶原合成的作用[J].天津医药,2004,32(10):633

[4]刘德伍,李国辉,刘德明,等.粉防己碱抑制瘢痕形成机理的研究[J].中药药理与临床,2000,16(6):10

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