牛膝多糖对小鼠骨髓来源树突状细胞抗肿瘤能力的影响

冯 婷,赵明耀,孙丽莎,李 沛,马俊芬,黄幼田,董子明

郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州 450001

#通讯作者,男,1953年4月生,教授,研究方向:肿瘤病因发病学、免疫及生物治疗,E-mail:dongziming@zzu.edu.cn

树突状细胞(dendritic cell,DC)因其具有强大的抗原提呈能力和诱导初始T淋巴细胞活化的能力,被认为是体内最有效的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),是识别病原侵入的第一道防线。尽管机体的免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答,但许多肿瘤细胞仍然能在机体内生长,这是因为机体内存在肿瘤的免疫逃逸机制。宿主体内DC的异常变化是肿瘤免疫逃逸机制的一个重要方面[1-2]。其中包括DC的数量减少、功能低下或缺陷。因此,如何提高DC的数量和增强其功能成为肿瘤治疗的一个重要方面。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharides,ABPS)是从牛膝根中分离的一种小分子水溶性多糖化合物,具有抗肿瘤、抗衰老、细胞毒和多种免疫调节作用[3]。目前有关ABPS对免疫功能的影响有较多的研究[4],但是未见其抗肿瘤作用是否与DC有关的报道。为此,作者进行了如下研究,探讨其抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要仪器和试剂 6～8周龄雄性昆明小鼠,体质量 20～24 g,购自河南省实验动物中心。人食管癌EC9706细胞株由郑州大学基础医学院病理生理学教研室常规传代培养。流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司),RPMI 1640培养基(美国Gibco公司),重组小鼠粒细胞巨噬细胞刺激因子(rmGM-CSF,杭州隆基生物技术有限公司),重组小鼠白细胞介素-2、-4(rmIL-2、rmIL-4,美国Perprotech公司),PE标记的抗小鼠CD11a单克隆抗体、FITC标记的抗小鼠CD86单克隆抗体(Ebioscience公司),荧光染料CFSE(Alexis公司),ABPS (山东泰安医药有限公司)。

1.2 小鼠骨髓源性 DC的诱导培养[5-6]颈椎脱臼法处死小鼠,无菌条件下提取小鼠骨髓细胞,用 37℃预温的Tris-NH4Cl红细胞裂解液去除红细胞,再用GKN缓冲液离心洗涤3次后,加入含100mg/L的青霉素和链霉素、体积分数为 10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含10μg/L rmGM-CSF,5μg/L rm IL-4)调细胞密度至5×106mL-1,以1m L/孔接种于24孔培养板。置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。48 h后弃去悬浮细胞,半量换液。于培养第 3天培养液中加入低、中和高质量浓度的ABPS(200、300及400 mg/L),设生理盐水对照组,以后隔日全量换液并补充ABPS。每组均设4个复孔。于第 5天负载 EC9706制备的冻融肿瘤抗原(郑州大学基础医学院病理生理学教研室传代培养保存)。用倒置显微镜每天观察细胞的生长状况,通过形态学变化观察其成熟情况。

1.3 DC表面标记CD86和CD11a的检测 细胞培养及分组方法同 1.2。于培养第 8天收集悬浮DC,PBS洗2次,分别加入FITC标记的CD86和PE标记的CD11a单克隆抗体各20μL,混匀放至4℃冰箱孵育30min,再用PBS洗2次,加1m L 40 g/L多聚甲醛固定 30 min,流式细胞仪检测CD86和CD11a的表达。

1.4 DC细胞周期的流式细胞术检测 细胞培养及分组方法同 1.2。于培养第8天收集另一部分悬浮DC,PBS洗2次,加入体积分数为70%乙醇4℃冰箱过夜,离心后弃乙醇,PBS洗,加入100μL RNA酶,轻轻吹匀,37℃水浴放置 30 min。再加入 100 μL碘化丙啶(PI)染料,4℃避光孵育30min后上流式细胞仪检测。DC增殖指数=(S+G2/M)/(G0/ G1+S+G2/M)×100%。

1.5 DC致敏的T淋巴细胞增殖指数检测 细胞培养及分组方法同 1.2。处死小鼠后无菌取其脾脏,研磨成单细胞悬液,用37℃预温的Tris-NH4Cl红细胞裂解液去除红细胞,再用GKN缓冲液离心洗涤3次,用体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含5μg/L rm IL-2)调细胞密度至5×107m L-1,培养6 h后收集未贴壁的T淋巴细胞。收集第8天的DC后经以上方法培养,与小鼠脾T淋巴细胞以 1:50的比例混合培养 3 d后收集T淋巴细胞,用流式细胞术检测细胞周期。T淋巴细胞增殖指数=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.6 DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测 细胞培养及分组方法同 1.2。收集传代培养的EC9706细胞,用CFSE进行染色,以经DC刺激的T淋巴细胞为效应细胞,EC9706细胞为靶细胞,效靶比为20:1,混合培养6 h,用流式细胞术检测T淋巴细胞的杀伤活性[1]。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计学处理,应用单因素方差分析比较不同组别 DC表面CD86、CD11a的表达、DC增殖指数、T细胞增殖指数及CTL杀伤活性等有无差异,用SNK-q检验进行两两比较,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ABPS和FTA冲击对小鼠DC形态的影响培养至第5天,ABPS中剂量组可见大部分细胞有突起伸出,并有大量的突起交织在一起,为典型的DC形态(图 1);低剂量组、生理盐水对照组仅有少量突起伸出,高剂量组细胞数量减少且突起不明显。用FTA冲击后培养至第7天,ABPS中剂量组细胞突起减少,由贴壁、半悬浮状态变为悬浮状态,细胞变大变圆,均匀散布于培养基中;低剂量组和生理盐水对照组悬浮的细胞少于中剂量组,多于高剂量组。

图1 ABPS对小鼠DC形态的影响(倒置显微镜,×250)

2.2 ABPS和FTA冲击对DC表面CD86及CD11a表达的影响 见表1。

表1 ABPS和FTA冲击对DC表面CD 86及CD 11a表达的影响

2.3 ABPS和FTA冲击对DC增殖指数、DC致敏T细胞增殖指数及DC诱导的EC9706 CTL的杀伤活性的影响 见表2。

表2 ABPS和FTA冲击对DC增殖指数、DCs致敏T细胞增殖指数及DC诱导的EC 9706 CTL的杀伤活性的影响

3 讨论

DC作为功能强大的APC,在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用,但是由于肿瘤组织产生的活性物质会抑制DC,使荷瘤宿主体内存在的DC出现功能缺陷而无法有效地递呈肿瘤抗原,进而无法激活 T细胞去识别和杀伤肿瘤细胞。因此,如何有效地促进机体DC细胞的增殖与成熟是目前肿瘤免疫治疗研究的重点之一。

多糖属于天然的免疫功能生物调节剂,也是一类新型高效低毒的抗肿瘤药物。有研究[2]显示 ABPS具有抗肿瘤作用,但其抗肿瘤作用是否与 DC有关,目前未见有关报道。

作者的实验结果表明ABPS在异源性抗原负载的条件下可以促进DC的分化、成熟及促进小鼠DC表面分子CD11a、CD86的表达;增强DC刺激T细胞的活化能力;增强DC诱导的CTL对EC9706细胞的杀伤能力。这是因为多糖本身可以作为生物信号调节分子结合到DC细胞的CR 3、TLR 2、TLR 4、Dectin-1或甘露糖受体上,其中DC相关C型凝集素-1是葡聚糖的主要受体[6]。ABPS的化学组成中主要有葡萄糖、甘露糖和果糖 3种单糖组分,由D-β-果糖组成,属果聚糖,组成比为果糖:葡萄糖 8: 1[3]。ABPS作用于相应DC的受体,启动细胞的增殖、分化和功能信号通路,使 DC的生物学效应增强。另外ABPS可促进集落刺激因子(CSF)、TNF-α与IL-2等细胞因子的分泌,产生类似的增强效应。

作者的研究结果还显示,ABPS中剂量组对DC表面CD86和CD11a的表达、DC增殖指数、DC致敏T细胞增殖指数及DC诱导的EC9706 CTL的杀伤活性均优于生理盐水对照组和高、低剂量组;且高剂量组各项指标明显下降,甚至低于对照组。前者可能是受体饱和效应现象,而后者是受体下调和(或)减敏现象抑或培养细胞渗透环境的改变所致,具体机制有待进一步的明确。有研究[7]表明某些多糖对免疫系统呈双向调节作用,提示把握ABPS抑癌作用的最适剂量特别重要。

[1]胡义杰,范士志,蒋耀光,等.人DeltaNp73α基因修饰的树突状细胞抗瘤免疫学效应研究[J].第三军医大学学报,2007,29(9):763

[2]任颖,银平章,孔令非.冻融抗原冲击致敏的树突状细胞抗肿瘤作用的研究[J].医药论坛杂志,2010,31(1): 32

[3]陈晓明,徐愿坚,田庚元.牛膝多糖的理化性质研究及结构确证[J].药学学报,2005,40(1):32

[4]金丽琴,许艳芳,金晶,等.牛膝多糖对老龄大鼠非特异性免疫功能的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23 (7):1 408

[5]夏俊波,吴奎,孙鲲,等.小鼠骨髓来源的树突状细胞体外扩增与鉴定[J].第三军医大学学报,2005,27(10): 942

[6]张群,雷林生,吴曙光.多糖类药物作用的受体及信号转导机制的研究进展[J].中草药,2005,36(4):614

[7]沈业寿,郑立军,王正亮,等.桑黄胞内多糖抗肿瘤效应的实验研究[J].癌变·畸变·突变,2007,19(4):305