雷帕霉素抑制m TOR信号通路对EC9706细胞生长及凋亡的影响*

王琼叶,侯桂琴,王莉莉,薛乐勋

1)郑州大学第一附属医院肿瘤细胞生物研究室郑州 450052 2)郑州大学药学院药理学教研室郑州 450001 3)郑州大学生物工程系细胞生物研究室郑州 450001

#通讯作者,男,1942年2月生,教授,研究方向:肿瘤与生物工程,E-mail:xuelx@371.net

细胞生长要受到高度复杂和精密的调控,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在细胞生长的调控过程中起重要作用,是细胞生长的中心调控因子[1]。以 m TOR为中心构成的信号传导网络在细胞生长过程中发挥关键作用。研究[1-3]表明,mTOR信号通路在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用,它所介导的信号转导通路的异常与多种恶性肿瘤有关,已成为肿瘤治疗的新靶点。mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin,rapa)是新型大环内酯类药物,对前列腺癌、乳癌及胰腺癌等恶性肿瘤均有一定疗效[4]。mTOR信号通路在食管鳞状细胞癌的发生发展中是否起作用以及rapa是否对食管鳞状细胞癌的生长增殖有抑制作用,国内外尚未见报道。作者采用免疫组化 SP法检测食管鳞状细胞癌组织中mTOR的表达情况,通过流式细胞术检测rapa对食管鳞状细胞癌细胞生长及凋亡的影响,为食管鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和细胞来源 HRP标记羊抗鼠IgG、SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;mTOR(sc-8319)抗体购自美国Santa Cruze公司;rapa、碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司;RNase购自大连宝生物公司,Annexin VFITC细胞凋亡试剂盒购自美国BD Biosciences公司。EC9706细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。

1.2 标本来源 取2001年 1月 1日至 2006年 8月 1日在安阳市肿瘤医院胸外科行初次手术且有完整临床病理资料的食管鳞状细胞癌组织石蜡标本50例,均经病理检查确定诊断。男 30例,女 20例,年龄 49～67岁,中位年龄 58岁;术前均未接受过化疗及放疗。以来自食管癌病发区无症状人群食管活检组织 15例(男 9例,女 6例,年龄40～59岁,中位年龄47岁)作为阴性对照。

1.3 细胞培养 细胞在含体积分数为10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)中生长,并置于37℃,体积分数为 5%CO2的条件下培养。

1.4 食管鳞状细胞癌及正常食管组织中m TOR蛋白的检测 石蜡切片标本常规脱蜡至水,严格按免疫组化试剂盒说明操作,DAB显色。mTOR一抗工作浓度1:50。选择5个视野(×400)的1 000个细胞进行观察。结果判定[5]:胞浆中有清晰棕褐色颗粒者为阳性细胞。着色强度计分:阴性为 0分;弱为1分;中等为2分;强为3分。着色分布计分:未着色为0分;10%～为1分;51%～为2分; 90%～100%为 3分。着色样式计分:未着色为 0分;零星着色为1分;聚集着色为 2分;弥散着色为 3分。结果取 3项计分之积:0分为阴性,≥1分为阳性。

1.5 细胞周期测定 取处于对数生长期细胞,分别用20、50和100 nmol/L rapa处理,24 h后收集细胞并制备单细胞悬液,用体积分数为 70%冷乙醇固定,4℃过夜。约106个细胞移入离心管中,PBS洗3次,加入RNase室温消化1 h,然后加入碘化丙啶(PI)染液,染色30 min,流式细胞仪检测各组中静止期(G0/G1)、合成期(S)、合成后期和分裂期(G2/ M)的细胞比例。用未处理细胞作为对照。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡检测 取处于对数生长期细胞,分别用20和50 nmol/L rapa处理,24 h后收集细胞并制备单细胞悬液,用 100μL冰预冷 1×结合缓冲液重悬细胞,将试管置于冰上;加5μL Annexin V-FITC和2.5μLPI到100μL的细胞悬液中,轻轻混匀;将试管置于冰上,室温避光孵育15 min;加入400μL 1×结合缓冲液,轻轻混匀,在 30 min内分析结果,以凋亡试剂处理的细胞作为阳性对照,未处理细胞作为阴性对照。以未染色细胞调零机器,以Annexin V-FITC单染管和PI单染管作为基准参照,测定每个上样管数据,利用CellQuest3.0软件进行参数获取和资料分析,计算 I区(继发死亡细胞区),Ⅱ区(早期凋亡细胞区)和Ⅲ区(活细胞区)的细胞百分比。实验重复 3次

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析,食管鳞状细胞癌和正常食管组织中mTOR的表达采用χ2检验,各组细胞周期分布和凋亡率的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌和正常食管组织中mTOR的表达 mTOR主要在胞浆中表达(图1)。m TOR在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达率为 64.0% (32/50),较正常食管组织的13.3%(2/15)高(χ2= 11.873,P=0.001)。

图1 正常食管组织及食管鳞状细胞癌组织中m TOR的表达(SP,×400)A:正常食管组织;B:食管鳞状细胞癌组织。

2.2 rapa对EC9706细胞周期的影响 见表2。

表2 不同浓度rapa对EC 9706细胞周期的影响(n=10) %

2.3 rapa对EC9706细胞凋亡的影响 见表3。

表3 不同浓度rapa对EC 9706细胞凋亡的影响 %

3 讨论

mTOR信号转导通路在调节细胞的凋亡、增生、分化等过程中起重要作用,与恶性肿瘤的发生、发展关系密切,已成为肿瘤治疗的新靶点[6]。mTOR在多种肿瘤中被显著激活而促进肿瘤发生,并且mTOR可直接使p70S6K磷酸化(p-p70S6K),pp70S6K促翻译活性高出未磷酸化p70S6K 100倍左右,从而促进蛋白合成[7],抑制此通路可以使细胞周期停滞,从而促进细胞凋亡产生[8]。研究[9-10]显示rapa衍生物及其细胞周期抑制剂779对前列腺癌、乳癌、胰腺癌等恶性肿瘤的良好的抗肿瘤作用。

目前针对食管鳞状细胞癌中mTOR信号通路的研究较少,该研究着重探讨食管鳞状细胞癌中mTOR信号通路的状态以及rapa是否抑制食管癌细胞的生长增殖,从而为食管鳞状细胞癌的靶向治疗寻找有效的药物。该研究通过免疫组织化学结果显示mTOR蛋白在食管鳞状细胞癌细胞中的表达较正常食管组织高,提示mTOR通路在食管鳞状细胞癌组织中处于激活状态,下一步的研究将通过检测mTOR下游靶蛋白来进一步证实该通路的激活状态。流式细胞术结果显示:不同浓度rapa处理组滞留在G0/G1期的细胞比例高于未处理组,提示rapa可使细胞滞留在G1期,从而抑制细胞的增殖;同时处于Ⅱ区(早期凋亡细胞区)的细胞比例处理组高于未处理组,提示rapa诱导细胞凋亡。但是rapa的促凋亡机制是否因为细胞长期处于 G1期而触发了凋亡还有待进一步证实。

综上所述,该研究初步探讨了食管鳞状细胞癌发生的可能分子机制即m TOR信号通路的激活在食管鳞状细胞癌的发生发展中起着一定的作用,而mTOR的抑制剂rapa可抑制食管鳞状细胞癌细胞生长并诱导凋亡,从而为靶向治疗食管鳞状细胞癌提供实验依据。

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