Cosmosil Cholester-HPLC法分离番茄红素异构体的研究

张连富, 张环伟

(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡214122;2.江南大学食品学院,江苏无锡214122)

番茄红素(Lycopene)是一种由11个共轭双键和2个非共轭双键组成的直链型多不饱和烯烃,分子式C40H56。由于番茄红素分子中含有的双键数目较多,分子不能内旋转、刚性较强,所以比较容易受光、热、氧、酸等因素的影响而产生空间异构体[1-2]。目前的研究发现,食物中(如番茄酱中)天然存在的番茄红素以全反式结构为主(90%～98%),而人体的血清和肾上腺等组织中含有的番茄红素主要是以顺式结构为主(79%～88%)——膳食与人体组织中番茄红素空间构型的差异性提示我们:顺式结构的番茄红素可能更有利于被人体吸收,如果对含番茄红素食物原料进行处理并提高其中顺式结构比例,就有可能提高产品的生物价并在此基础上大幅提高其生物活性作用[3]。为了弄清上述问题,就必须获得人体中常见番茄红素空间异构体的单体并进行体内、体外试验研究,而实现番茄红素不同异构体的分离是实现上述目标的首要前提。为此,作者本文即对 HPLC分离番茄红素异构体这种方法进行研究。

由于番茄红素各异构体间在极性、分子大小等方面差异很小(图1),要实现他们之间的分离比较困难。目前国内外普遍采用的分离方法是高效液相色谱法,主要有两种方式:一种是采用C30柱来分离,但C30柱对分离不同类胡萝卜素效果较好,对番茄红素的顺反异构体的分离效果则不是很理想[4-6];另一种是Schierle J等建立的利用3根Nucleosil 300-5正相色谱柱联用的方法对番茄红素的异构体进行分离,这种方法实现了顺反异构体的分离,但对顺式异构体间的分离效果也不十分理想。而且,3根色谱柱联用在实际操作中也有很大的麻烦,需要长时间的平衡操作才能使色谱柱达到平衡状态[7]。

鉴于目前所采用的色谱柱都存在一定的缺点,作者尝试利用Cosmosil Cholester色谱柱来实现番茄红素各异构体之间的分离:Cosmosil Cholester柱是Nacalai Tesque Inc.开发的反相体系的HPLC柱,采用胆甾醇键合硅胶填料,具有与传统的烷基键合C18、C30硅胶填料一样的疏水性,因而其对功能基的选择能力几乎相同;但在分子形状特别是空间立体异构体的识别能力上Cholester柱的性能非常高。 等利用此种色谱柱对ceriporic acid异构体进行了分离,取得了较好的分离效果[8]。考虑到ceriporic acid异构体分离与番茄红素空间异构体的分离具有一定程度的相似性(图2),作者对Cosmosil Cholester-HPLC体系分离番茄红素空间异构体进行了尝试。

图1 番茄红素的几种常见的顺反异构体Fig.1 Structure of the all-trans/cis-isomers of lycopene

图2 Ceriporic acid结构图Fig.2 Structrure of Ceriporic acid isomers

1 材料与方法

1.1 试验材料

全反式番茄红素(纯度90%):华北制药股份有限公司产品。

乙腈:AP,上海凌峰化学试剂有限公司产品;四氢呋喃:AP,上海试四赫维化工有限公司产品;乙酸乙酯:AP,国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 试验仪器

UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计;高效液相色谱仪Ⅰ(P3000型高压输液泵,UV3000可变波长紫外/可见分光检测器):北京创新通恒科技有限公司产品;高效液相色谱仪 Ⅱ(Waters 2695型HPLC,Waters 996二极管阵列检测器;Masslynx工作站);色谱柱:Cosmosil Cholester柱(4.6 mm×250 mm,5μm)。

1.3 试验方法

1.3.1 异构化番茄红素样品的制备 参照Pierre Lambelet等[9]的方法进行顺式化处理:称取0.020 0 g的番茄红素溶于100 mL乙酸乙酯中热回流24 h。通过对反应前后的样品进行全波长扫描,出现了文献中报道的362 nm处的顺式峰(图3)。说明此样品中已经含有了顺式异构体,可以用于分离,摸索试验条件。

图3 反应前后的全波长扫描图谱Fig.3 UV-Visible spectra of lycopene samples before and after isomerization

1.3.2 检测方法 对反应前后的样品进行全波长扫描,确定样品中含有番茄红素顺式异构体;用高效液相色谱仪Ⅰ对流动相比例、进样量、流速等试验条件进行优化,将出峰个数、分离度R及峰形等3个指标作为分离效果的判断标准,得出最佳分离条件;用高效液相色谱仪Ⅱ进行不同仪器间的重复性试验。

2 试验结果与讨论

2.1 流动相的选择

综合考虑各种试剂的性质和对番茄红素的溶解性性质,选取的试验溶剂为四氢呋喃、乙酸乙酯与乙腈。选取的两种流动相为:A)乙酸乙酯:乙腈,B)四氢呋喃(THF):乙腈。

从色谱图中可以看出,两种流动相在相同的配比条件下均对样品中的物质达到了分离的目的,分离出的峰的个数也相同。对各峰的分离程度和峰形等方面来看,结果也大致相同,采用流动相A的分离度(Rmin=1.7)要稍好于用流动相B(Rmin=1.3)。但是从保留时间来看,用A为流动相的保留时间(tR=68 min)明显长于B(tR=42 min),这样造成了分离成本的增加,所以试验采用四氢呋喃和乙腈作为流动相。

图4 不同流动相条件下分离样品的色谱图Fig.4 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase

2.2 流动相比例的确定

由上步选取流动相后,选择不同比例的流动相来进行试验,采取V(THF)∶V(乙腈)=25∶75、10∶90、5∶95 3个比例来进行试验,试验结果如图5。

图5 不同流动相比例下分离样品的色谱图Fig.5 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase ratio

由上图可知,随着流动相中极性物质乙腈含量的增加,番茄红素异构体的分离效果越好。在V(THF)∶V(乙腈)=25∶75时,只分出了3个峰。当两者的比例达到10∶90时,可以分出5个峰,分离效果较好。但是当两者的比例达到5∶95时,分离效果与10∶90相似,但保留时间几乎延长了一倍。流动相比例采用10:90的比例来进行试验。

2.3 流动相流速的确定

流动相的流速对番茄红素异构体分离效果有一定的影响,根据本试验所采用的仪器的性质和承载能力,采用的流量为 1.4、1.0、0.6 mL/min 3个梯度。

流动相的流速对峰的分离效果的影响并不是十分明显(图6)。当流量低时,分离效果稍好,但保留时间太长,减短了仪器的使用寿命。当流量增大时,泵的压力过大,对仪器的损害也是很大的。采用了比较常用的流量1 mL/min。

2.4 进样量的确定

研究了进样量对番茄红素异构体分离效果的影响,由于进样阀的最大容积(20μL)的限制,所以采用的进样量为20μL和10μL。

图6 流动相不同流速分离样品的色谱图Fig.6 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase flowrate

试验结果表明(图7),在进样量为20μL时,分离度和10μL进样的结果没有大的区别。采用高效液相色谱仪Ⅱ检测的30μL进样,分离度小于20 μL进样,由于样品量太大,柱子的载量有一定的限度,流动相在没有将前种物质完全洗脱出来的时候,后种物质已经溶解于流动相中被洗脱出来,所以若进样量过大,分离效果不是很好。采用的10 μL和20μL进样对分离效果无明显影响,则采用20μL的进样量将有利于试验效率的提高。

图7 不同进样量下分离样品的色谱图Fig.7 Chromatograms of isomerized lycopene under different sample injection

2.5 重复性试验

为了检测试验条件的可靠性,在以上试验确定的试验条件的基础上,进行重复性试验。图8为高效液相色谱仪Ⅰ分离的色谱图。同时,进行了不同仪器间的验证性试验,采用高效液相色谱仪Ⅱ对样品进行重复性试验,得到的试验结果如图9所示。

图8 高效液相色谱仪Ⅰ分离的色谱图Fig.8 Chromatogram of sample using HPLC I

图9 高效液相色谱仪Ⅱ分离的色谱图Fig.9 Chromatogram of sample using HPLC Ⅱ

从上面两张色谱图可以看出,作者所确定的试验条件对样品中的组分实现了分离。对分出的组分进行初步鉴定,从全波长扫描图得出以上5个峰为同类型物质,可以认定为番茄红素的异构体。所以,此试验条件可以用于番茄红素异构体的分离。与Pierre Lambelet等[9]所采用的3根正相柱联用的方法相比,在对样品进行了同样的处理后进行分离,分离到了5个色谱峰,而且最小分离度也达到了1.3,基本可以将各个峰分开,并且此方法操作简便,平衡时间短。而3根正相柱联用的方法只分出了4个色谱峰,操作较复杂。所以本试验基本达到预期效果。

在所确定的测定条件下,异构化处理前番茄红素样品(全反式)的色谱图及其中主要组分(全反式番茄红素,响应时间为33.95 min)的UV-Vis光谱如图10、11所示。对比处理后的色谱图可知,所确定的番茄红素异构体分离条件适当,操作稳定,重现性良好。

图10 标准番茄红素样品的液相色谱图Fig.10 Chromatogram of standard all-trans lycopene sample

图11 标准番茄红素样品的 UV-Vis光谱图Fig.11 UV-Visible spectra of satandard all-trans lycopene sample

3 结 语

通过对Cosmosil Cholester柱分离番茄红素异构体的条件进行优化试验,得到了一种可以较好分离番茄红素异构体的方法,并确定了分离条件为:流动相为V(四氢呋喃)∶V(乙腈)=10∶90,进样量20μL,流量1 mL/min,检测波长472 nm。并在此试验条件下进行了重复性试验,证明了此方法的重现性较好。与Schierle J等建立的3根Nucleosil 300-5正相色谱柱联用法[7]相比,作者所使用的方法操作简便,避免了由于3柱串联所造成的漂移,易于实现色谱柱的平衡;与C30柱法[4-6]相比,本方法对各顺式峰的分离效果更好些,分离效果基本达到完全分离要求。

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