硒强化剂的急性和蓄积毒性试验研究

胡 滨, 陈一资＊, 辜雪冬

(1.四川农业大学食品学院,雅安625014;2.西藏大学农牧学院,林芝860000)

硒是人体必需的微量元素之一,它具有清除体内自由基、提高免疫力以及拮抗重金属等方面的生物学功能,它还与人类心血管疾病、生殖系统疾病以及骨关节疾病的发生具有相关性[1-2],因此作为一种保健食品原料已广泛应用。但硒的安全剂量和中毒剂量之间的范围相当狭小,一旦超出其安全剂量,就会引起人体的硒中毒[3-5]。本试验旨在用保健食品常见的硒强化剂亚硒酸钠对小鼠进行不同剂量灌胃,通过急性、蓄积性毒性试验,建立小鼠硒中毒的动物模型,为硒的毒理学安全性评价积累资料。通过硒对小鼠生长性能变化、血常规、血液生化指标、主要器官组织病理学变化等进行系统综合研究,了解高浓度硒的危害,防止由于硒摄入过量而对人造成毒害,为生产富硒保健食品和食品监督部门的安全监管提供可靠科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 清洁级昆明种小鼠180只,雌雄各半,体重20±2g,成都实验动物中心提供。小鼠专用生长维持饲料:成都实验动物中心提供。饲养温度 22～25℃,湿度40%～60%,自然采光条件。

1.1.2 受试物 亚硒酸钠(Na2SeO3·5H2O):分析纯,含量>99%,成都市科龙化工试剂厂生产。

1.1.3 主要器材和试剂 全自动生化分析仪:7020型,日立电子公司生产;电子天平:TE412-L型,德国赛多利斯公司生产;超纯水仪:Milli-Q型,美国密理博Millipore公司生产;硫酸,硝酸,高氯酸,盐酸,氢氧化钾,高锰酸钾,乙醇等,均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验

1)预实验 将亚硒酸钠用超纯水溶解后配成不同浓度溶液,再按小鼠体质量灌胃。取小鼠70只随机分为7个组,每组10只,禁食14 h,不禁水,采用一次性灌胃给药。用药剂量分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/kg。灌胃后连续观察 7 d[6]。

2)正式试验 根据预备试验所得最小致死剂量a=2.0 mg/kg,最大致死剂量b=8.0 mg/kg,则组间剂量比急性毒性正式实验设置5个剂量组和1个对照组,每组10只,每组分别按 2.0、2.82、3.98、5.61、7.90 mg/kg 剂量一次性灌胃,对照组以超纯水进行灌胃。灌胃后连续观察7 d,观察小鼠精神、食欲、饮水、活动并记录小鼠中毒情况、死亡时间和死亡只数[6]。

1.2.2 蓄积性毒性实验

1)动物的分组和给药 采用20d蓄积性毒性试验法来判断硒对小鼠的蓄积毒性强度。设置4个试验组和1个对照组,每组10只。试验组分别按1/20、1/10、1/5、1/2 LD50剂量每日灌胃一次 ,对照组灌胃超纯水,连续灌胃20 d。

2)检查内容 观察记录各组小鼠的精神、活动、饮水、食欲等变化,并记录死亡情况。在实验第21天剖杀全部小鼠取血及主要脏器,系统研究亚硒酸钠对小鼠脏器指数,剖解、组织病理变化,血常规、血液生化等的影响[6]。

1.3 数据统计

2 结果与分析

2.1 急性毒性实验结果

试验Ⅴ组、Ⅳ组小鼠在灌胃4 min后开始出现小鼠活动减少,嗜睡,乏力,反应迟钝等状况。随后精神极度沉郁,站立不稳,呼吸困难,全身抽搐后死亡。随着时间延长其他组小鼠陆续出现类似情况。各组小鼠死亡情况如表1所示。根据改良寇氏法算得:LD50=3.86 mg/kg;LD5095%的可信区间为3.82～3.90 mg/kg。

表1 急性毒性试验小鼠死亡结果Tab.1 Results of mice died oin acute toxicity experiments

2.2 蓄积性毒性实验结果

2.2.1 临床观察 对照组和Ⅰ组小鼠在试验期间食欲正常,精神良好,个体增重迅速,未出现死亡现象;Ⅱ组和Ⅲ组小鼠在试验初期,个别小鼠精神不佳,部分小鼠皮肤变得松弛,被毛凌乱,食欲减损,未出现死亡现象;Ⅳ组小鼠灌胃后也有不适现象,随着染硒时间延长,出现食欲减损、行动迟缓、被毛凌乱,体重下降等状况,并在第17 d,19 d分别死亡小鼠1只。各组体重变化情况如表2所示。

由表2知,试验开始时,各组小鼠平均体重差异不显著(P>0.05)。在试验第7d,对照组与Ⅰ组、Ⅱ组差异不显著(P>0.05);对照组与Ⅲ组、Ⅳ组差异显著(P<0.05)。在试验第14d,对照组与Ⅰ组差异不显著(P>0.05);对照组与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组差异显著(P<0.05),Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组之间差异不显著(P>0.05)。在试验第21d,对照组与Ⅰ组差异不显著(P>0.05),对照组与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组差异显著或极显著(P<0.01)。

整个试验阶段所有组别小鼠平均体重都随时间在一直增长,但不同染毒组随染毒剂量增大及染毒时间的延长,平均体重增幅逐渐减小。在初始体重差别极小情况下,Ⅲ组、Ⅳ组小鼠在整个实验阶段体重增幅明显低于对照组,说明对小鼠灌胃0.77 mg/kg和1.93 mg/kg剂量的硒有阻碍生长的作用。其原因可能是随着硒摄入量的增加对小鼠产生毒性作用,干扰了小鼠正常生理代谢,故降低了体重增幅。此外,Ⅳ组小鼠在试验期间出现死亡,可能也是引起该组小鼠平均体重增幅降低的原因之一[7]。

表2 各组小鼠平均体重的测定结果Tab.2 Average body weight(g)of different groups (单位:g)

2.2.2 病理剖解变化 剖检中毒死亡小鼠发现其皮毛松弛,凌乱;心脏有不同程度的肿胀,胸腔出现充血;肝脏明显肿大,色泽变黑,肝表面有明显颗粒状物质;肾脏出现肿大;脾脏出现肿大现象。死亡小鼠胃肠道肉眼观察未见异常。

2.2.3 组织病理学变化 肝脏:Ⅰ组无明显变化,Ⅱ组和Ⅲ组出现有颗粒变性以及轻微的间质增宽现象,Ⅳ组出现细胞浊肿,胞浆疏松,有颗粒变性和空泡变性。脾脏:Ⅰ组未见有病变;Ⅱ组和Ⅲ组在脾髓内充满血液,红髓的脾窦有充血现象;Ⅳ组脾髓充血,白髓缩小、出血。肾脏:Ⅰ、Ⅱ组肾脏都未见异常;Ⅲ组、Ⅳ组有肾小球体积增大,间质小血管扩张淤血,肾小管上皮细胞胞浆嗜酸性增强,有颗粒变性等现象;心脏:第Ⅳ组心肌纤维部分肿胀,断裂,有颗粒变性;其他组织镜下未见异常变化。

2.2.4 脏器指数

本实验的脏器指数如表3所示。

表3 不同硒水平对小鼠脏器指数的影响Tab.3 Effect of selenium level on the mice viscera index

由表3知,心脏指数:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组与对照组差异不显著(P>0.05),Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05),Ⅳ组与对照组差异显著(P<0.05)。这与病理解剖观察到死亡小鼠心脏肿大相一致,说明摄入高剂量硒会引起小鼠心脏肿大,胸腔充血[9]。肝脏指数:Ⅰ组与对照组差异不显著(P>0.05),Ⅱ组和Ⅲ组与对照组差异显著(P<0.05),Ⅳ组与对照组差异极显著(P<0.01)。这与病理解剖观察到死亡小鼠肝脏肿大相一致[10-11]。脾脏指数:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组与对照组差异不显著(P>0.05),Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05),Ⅳ组与对照组差异显著(P<0.05),这与病理剖解观察到死亡小鼠脾脏肿大相一致[12]。肾脏指数:Ⅰ组与对照组差异不显著(P>0.05);对照组与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。说明灌胃0.386 mg/kg硒时,可能会引起小鼠肾脏的损害,造成肾脏肿大。这与病理组织学观察结果相一致。肺脏指数:4个染硒组与对照组差异不显著(P>0.05)。

2.2.5 血常规检测 本实验的脏器指数如表4所示。

由表4知,对照组的各项血常规指标与Ⅰ组差异不显著(P>0.05),与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组之间的 WBC、RBC、Hb、PCV、N、L 差异显著(P<0.05),详情见表4。

实验Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(Hb)、血小板数(PL T)、红细胞压积(PCV)均显著下降,可能是由于硒摄入过量后影响了骨髓造血机能,导致红细胞生成减少,血小板生成障碍,以致血红蛋白量、红细胞压积降低。实验Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的白细胞数(WBC)、中性粒细胞数(N)均不同程度下降,原因可能是脾脏发生病变引起。脾脏是体内重要的免疫器官,与机体免疫功能关系密切。病理切片观察红髓内细胞成分减少,白髓缩小,说明脾脏遭到损伤;白细胞又是体内的免疫细胞,中性粒细胞在白细胞总数中所占比例较大,随着硒摄入量增加,对机体免疫功能产生一定抑制作用,造成二者数量都下降[11];实验Ⅰ组的淋巴细胞(L)数量略高于对照组,而Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的显著低于对照组,由于淋巴细胞数量直接反应机体免疫功能高低,在实验中的Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组淋巴细胞数量下降,说明随着硒的摄入剂量增加,可能对小鼠的免疫系统功能产生了抑制作用。

2.2.6 血液生化指标检测 本试验血液生化检测指标结果见表5。

表4 不同硒水平的小鼠血常规测定结果(n=5)Tab.4 Effect of selenium level on the mice viscera index at different group(n=5)

由表 5知,对照组的总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、A/G值与第Ⅰ组差异不显著(P>0.05),而对照组的 TP、ALB、A/G值与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),各组的球蛋白(GLO)都差异不显著(P>0.05)。第Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的 TP、ALB、A/G值都不同程度降低,可能是硒摄入过量后对肝脏造成损伤,使肝脏合成蛋白质的能力下降,导致总蛋白和血清蛋白含量降低,A/G值下降也提示动物肝功能可能受损。这与病理组织观察到Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组肝脏病变相一致。对照组的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(AL T)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(A KP)均与Ⅰ组差异不显著(P>0.05),与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的AST、AL T、A KP活性与对照组差异显著或极显著,可能是小鼠肝细胞变性坏死后,AST、ATL、A KP从受损的肝细胞中大量逸出,造成其在血清中活性明显升高;正常情况下血清中AST活性很低,心脏的活性很高,当硒摄入过量引起心肌纤维断裂,细胞膜通透性增高,AST大量释放入血,可能也是造成血清中活性明显升高的原因;当肾小管上皮细胞受损也可释放A KP,导致血清A KP活性升高。LDH也可作为判断心脏或肝脏发生病变的指标。LDH增高可能是随着摄入硒的剂量增加对小鼠肝脏造成损坏而引起,也可能是由于小鼠心脏肿大受损而引起。这与解剖学及组织病理学观察到肝脏、肾脏、心脏发生病变相一致。各组的甲胎蛋白和癌胚抗原都呈阴性,说明各组小鼠的肝脏都未发生致癌变化。

3 结 语

1)由急性毒性实验所得小鼠经口LD50为3.86 mg/kg,按中国毒理学经口急性毒性评判标准为剧毒物质,小鼠发生急性硒中毒的主要靶器官是肝脏和心脏。但由于低剂量的硒对动物生长有促进作用,因此在保健食品中添加亚硒酸钠时务必控制其用量,避免人体发生急性中毒。

2)蓄积性毒性实验表明亚硒酸钠属于弱蓄积性物质,小鼠发生硒蓄积性中毒的主要靶器官是肝脏、心脏、脾脏和肾脏。当染硒剂量为0.39、0.77、1.93 mg/kg时,3个组小鼠体质量增长缓慢,生长发育受阻。随染硒剂量的增高,小鼠生长受阻现象越严重。当染硒剂量为0.19 mg/kg时,对小鼠有一定促生长作用,即低剂量的硒有助于动物生长发育[13-14]。

硒虽然是人不可缺少的微量元素,但不能摄入过量,否则会对机体带来急性和蓄积性损害作用。在补硒食品的生产过程中,为了保障人们食品安全,不应盲目增加食品中硒的添加剂量,硒的添加剂量要控制在人体的安全摄入量范围之内,要保证高硒地区不致发生硒中毒,低硒或缺硒地区居民满足生理和最低需要量。

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