慢性HBV感染患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞表达及其临床意义*

吕 峰 郜玉峰 崔明芳 张振华 尹华发

在HBV感染中，T淋巴细胞作为主要的效应细胞，与病毒的清除直接相关。但研究发现，慢性HBV感染者常表现为免疫细胞功能低下，CD4+CD25+调节性T细胞能通过细胞直接接触而抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞等细胞的活性，在细胞免疫调节中具有重要的作用。CD4+CD25+调节性T细胞在外周循环中的表达频率和功能改变直接影响到细胞免疫反应的强弱，从而决定抗病毒的疗效。因此，本文通过研究CD4+CD25+调节性T细胞在慢性乙型肝炎（CHB）、无症状HBsAg携带者（ASC）和肝炎肝硬化（LC）患者外周血单个核细胞（PBMC）的表达水平及其与不同临床转归的相关性，以探讨其在慢性乙型肝炎发病机制中的作用。

材料与方法

一、研究对象 我科2008年9月至2009年3月门诊和住院的CHB患者26例，ASC 15例，LC患者11例。男性42例，女性10例，平均年龄35±11岁。诊断均符合2000年中华医学会修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准[1]。所有病例均未合并其他嗜肝病毒感染或其它慢性疾病，排除了重叠HIV感染，入组前3个月内未应用任何抗病毒治疗，无胸腺肽、免疫球蛋白、甘草酸类、联苯双脂等药物治疗史。另选16例正常对照者，男9例，女7例，平均年龄34±12岁。

二、主要仪器及试剂 FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；Centrifuge 5810R和5415R型离心机购自德国Eppendorf公司；MODULAR—DPP型全自动生化分析仪购自上海罗氏公司；7300型RT-PCR机购自美国ABI公司。IgG-异硫氰酸荧光素（FITC）、IgG-藻红蛋白 （PE）、IgG-叶绿素蛋白 （Percp）、抗CD25-FITC、抗CD4-PE、抗CD3-Percp试剂购自美国Ebioscience公司；淋巴细胞分离液购自北京Solarbio公司；RPMI-1640培养液为自行配制，干粉购自美国Flow公司。

三、外周血T淋巴细胞亚群和CD4+CD25+调节性T细胞的检测 新鲜采集的EDTA抗凝全血，应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，用含有10%牛胎血清的RPMI-1640培养浓集，37℃，5%CO2温箱条件下培养24小时后收获细胞。根据细胞计数取大约105细胞，加入人新鲜血清或IgG，放置30分钟以封闭细胞表面Fc段受体，然后加入抗CD25-FITC、抗CD4-PE、抗CD3-Percp试剂表面染色，同时另取一管加入IgG-FITC、IgG-PE、IgG-Percp作为同型对照。4℃，避光放置30分钟后用PAS洗三次，加固定液，再放置4℃避光30分钟，上机检测。使用CELLQUEST软件进行分析，以前向角散射光（FSC）为横坐标，侧向角散射光（SSC）为纵坐标，建立二维散点图，在散点图上调整阈值参数，排除碎片和噪声的干扰，圈定淋巴细胞设门以获取细胞。以同型对照分别设定不同荧光素的阴性界限，检测并记录荧光抗体染色阳性CD3+和CD4+分子的表达情况。再以CD3-SS设门，将CD4+CD25+T细胞亚群作为CD4+CD25+调节性T细胞的表型，分析门内CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的百分率，采用Winmdi Version2.8功能软件进行数据分析。

四、临床指标的检测 采用ELISA法（上海科华生物科技有限公司）检测HBV血清学标志物；采用罗氏全自动生化分析仪检测肝功能；采用荧光定量PCR法（广州中山大学达安基因有限公司）检测HBV DNA。检测结果以＞103copies/ml判断为阳性。

五、统计学处理 各组间数据取均数±标准差表示，所有资料均使用SPSS 11.0统计学软件进行t检验和直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组患者CD4+CD25+调节性T细胞的比例

CHB组、ASC组及正常对照组外周血CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例分别为4.40±2.76%、4.43±2.10%和2.70±0.97%，CHB组和ASC组的CD4+CD25+调节性T细胞比例较正常对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表 1。

表1 HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群及CD4+CD25+调节性T细胞的百分率（%）

二、慢性HBV感染者HBeAg与CD4+CD25+调节性T细胞的关系 HBeAg阳性组CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+比例为4.17±2.30%，HBeAg阴性组为4.30±2.43%，两者差异无统计学意义（t=-0.181，P＞0.05）。但两组与正常对照组比较均有显著性差异（P＜0.01），见表 2。

表2 HBeAg与CD4+CD25+调节性T细胞百分率（%）的关系

三、慢性HBV感染者HBV DNA水平与CD4+CD25+调节性T细胞的关系 根据HBV DNA水平将患者分为高拷贝组（＞105copies/ml）和低拷贝组（＜105copies/ml）。结果HBV DNA高拷贝组患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+比例为4.23±2.12%，而HBV DNA低拷贝组为4.28±2.73%，差异无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

CD4+CD25+调节性T细胞能维持免疫耐受和抑制抗原特异性或非特异性T细胞应答。国内外研究认为，在HBV感染者中针对HBV特异性的T细胞应答的减弱可能与CD4+CD25+调节性T细胞的作用有关，并且与HBV感染后病毒的清除、病情进展及临床转归有密切的关系[1]。Franzese等[3，4]在慢性HBV感染者中发现CD4+CD25+调节性T细胞对HBV特异性CTL细胞和Th细胞有抑制作用，并参与了HBV感染的慢性化过程。CD4+CD25+调节性T细胞水平增高的原因可能与CD4+CD25+调节性T细胞表面的一些负性共刺激因子过度表达有关，如 CTLA-4、PD-1、Galectin-9 等[5～8]可能影响它的表达水平和功能改变。我们的研究结果发现：在CHB和ASC组CD4+CD25+调节性T细胞的表达率均显著高于正常对照组，但CD4+CD25+调节性T细胞的表达率在CHB、ASC和LC三组中无统计学差异（P＞0.05），可能与病例数较少有关。对于CHB患者，CD4+CD25+调节性T细胞数量是否增加仍存在争议。Franzese等[3]发现免疫耐受患者、慢性活动性乙型肝炎患者及无症状HBV携带者CD4+CD25+调节性T细胞数量与健康对照之间无明显统计学差异。这些仍需大样本观察的验证。

我们的观察结果显示，慢性乙型肝炎患者外周循环中CD4+CD25+调节性T细胞的频率与血清转氨酶水平无相关性（资料未列出）。这与Xu等[9]通过对l6例AHB、76例CHB和29例慢性重型肝炎患者外周循环和肝脏中浸润的CD4+CD25+调节性T细胞的频率、表型特征分子和对抗病毒应答的影响等进行研究的结果一致。本文发现CD4+CD25+调节性T细胞的表达与外周血HBV DNA水平及HBeAg阳性与否也无明显的相关性，与沈俊辉等[10]研究结果相同，但与Stoop和Peng等[4，5]研究结果有所不同。他们报道CD4+CD25+调节性T细胞频率与血清病毒载量呈正相关，HBeAg阳性的HBV感染者CD4+CD25+调节性T细胞水平明显高于HBeAg阴性者，可能的原因是HBeAg的存在更容易激发机体的免疫反应，进而促进CD4+CD25+调节性T细胞的过度表达，以达到免疫抑制的目的，免疫抑制效应又促进了病毒的复制，在CHB的免疫耐受中起一定的作用。

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