TLR9受体介导枯否细胞对转染HepG2细胞HBx信号转导的抑制作用

范熠 唐宇 高燕

类铎受体（Toll-like receptors，TLRs）是近年来发现的模式识别分子，在诱导免疫应答中具有非常重要的作用。胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸（cytidine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides，CpG ODN）是TLR9的激动剂，它能够有效地增强机体的免疫功能，从而成为研究热点。CpG能够激活多种天然免疫细胞抑制细菌、病毒和寄生虫等病原体的感染和增强机体的抗肿瘤效应[1]。通过激活肝脏内的巨噬细胞-枯否细胞（Kupffer cells，KC）功能，CpG 能够抑制某些肝脏疾病的发生[2]，抑制肿瘤的增殖与转移[3]。然而，CpG抑制肝癌细胞增殖与转移的具体机制尚不清楚。研究已证实，乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）是导致肝癌恶化的多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用。因此，本研究对CpG是否通过KC细胞干扰HBx信号转导进行了初步研究。

材料与方法

一、动物、质粒和细胞株 雄性BABL/c小鼠，8～12周龄，由本校动物中心提供。重组表达质粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO-HBx和空质粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO及人肝母细胞瘤HepG2细胞均由本室保存。

二、主要试剂 TLR9激动剂CpG ODN1826、对照ODN1826 Control和脂质体转染试剂盒LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual Luciferase Reporter Gene Assay）购自美国Promega公司；鼠抗人β-actin抗体和抗HBx抗体均购自美国Santa公司；Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶E和Percoll细胞分离液均购自美国Sigma公司；FITC anti-mouse F4/80抗体购自美国Ebioscience公司；检测小鼠干扰素-α、γ（mouse IFN-α、γ）ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

三、KC细胞的分离与鉴定 根据严茂林等[4]报告的两步灌注法，应用0.05%Ⅳ型胶原酶和链霉蛋白酶E溶液对BALB/c小鼠肝脏进行原位灌注，将获得的细胞悬液用35%～65%Percoll细胞分离液进行双层密度梯度离心。分离的KC细胞经贴壁培养1h后换液，继续培养24h后用0.25%胰酶消化，收集KC细胞。将KC细胞与FITC anti-mouse F4/80抗体冰浴30min，进行流式细胞术（fluorescence activated cell sorting，FACS）检测，以分析细胞的纯度。

四、转染HepG2细胞HBx蛋白表达的检测 采用Western blotting法，分别取1×107个重组表达质粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO-HBx和空质粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO转染HepG2细胞，12%SDS-PAGE电泳，取下凝胶，将蛋白质在100V转印1h至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），再将该PVDF膜用5%脱脂奶粉-吐温封闭过夜，PBS-T漂洗，加入用5%脱脂奶粉稀释的鼠抗人 β-actin抗体和抗 HBx抗体（1：1000），在室温下孵育2h，PBS-T洗膜3次，加入5%脱脂奶粉稀释并与辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG（1：5000）孵育，室温轻摇2h，PBS-T洗膜3次，DAB避光显色5min，摄像。

五、质粒转染HepG2细胞酶活性检测 转染前1d，取对数生长期HepG2细胞铺24孔板，每孔500μl DMEM完全培养基含1.5×105个细胞，次日，细胞生长融合度达95%。转染前更换为无血清的培养基待用，转染时按LipofectiamineTM 2000试剂盒要求分别进行HBx表达质粒和空质粒转染操作。转染后的HepG2细胞用无抗生素的完全培养基继续培养24h。弃去原培养基，加入新鲜培养基500μl。在HBx转染HepG2细胞孔中加入1×106个KC细胞，设不加细胞对照，再分别加入TLR9激动剂CpG ODN1826或对照ODN1826 Control，使其终浓度为10μM。继续培养12h后收集上清液待用，贴壁细胞用双荧光素酶报告基因检测试剂盒处理，分别测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性值，并计算酶的相对活性。细胞转染和荧光素酶活性检测重复3次，每次均设置复孔。

六、培养上清液干扰素的检测 将培养上清液进行离心，取50μl上清液，采用ELISA法分别检测干扰素-α和γ。以IgG标准品浓度为横坐标（对数坐标），吸光度（A值）为纵坐标绘制标准曲线，查找被检样品的相应浓度。每次设置复孔，干扰素的检测重复3次，取平均值。

七、统计学分析 双荧光素酶检测结果以空质粒转染HepG2的结果为参照，对各组数据进行标准化处理并计算出相对比值。应用SPSS10.0统计学软件对数据进行方差分析，P<0.05被认为具有显著性差异。

结 果

一、转染HepG2细胞HBx蛋白的表达 检测发现重组表达质粒转染的HepG2细胞能够表达HBx蛋白，分子量为17kD，与预期相符，而空质粒转染的HepG2细胞不表达HBx蛋白，见图1。

图1 转染HepG2细胞中HBx蛋白的表达

二、KC细胞的鉴定 成功分离的KC细胞经培养24h后，细胞形态较好，均伸展成梭形或不规则形，见图2。

图2 KC细胞的形态学表现

用荧光抗F4/80标记后进行流式细胞术分析，发现其纯度为83.6%，见图3。台盼蓝染色显示细胞活力＞95%。

三、转染HepG2细胞HBx转导NF-κB信号的变化

在HBx转染的HepG2细胞培养体系中加入KC细胞和TLR9激动剂进行共培养，采用双荧光素酶试剂盒检测HBx介导的NF-κB信号通路的活化状况，以空质粒转染组为对照进行标准化处理。结果显示，与HBx转染组（4.83±0.56）比，加入 KC细胞和 TLR9激动剂后双荧光素酶的相对活性显著下降（3.14±0.85，P＜0.05），约为HBx转染组的65%；而加入KC细胞和TLR9激动剂对照对NF-κB信号通路的活化无显著性影响（4.69±0.52，P＞0.05），见图 4。

图4 HBx介导的NF-κB信号活性比较

图3 流式细胞术检测KC细胞纯度

四、KC细胞依赖的转染HepG2细胞HBx介导的NF-κB信号变化 进一步对抑制HBx介导NF-κB信号活性的KC细胞进行剂量依赖性分析。在HBx转染的 HepG2 细胞培养液中分别加入 1×105、1×106和1×107个KC细胞，孵育后进行双荧光素酶分析，结果显示加入不同数量的KC细胞后NF-κB信号活性存在显著性差异（P＜0.05），即随着KC细胞数量的增加，双荧光素酶的相对活性逐渐下降，见图5。

图5 不同数量的KC细胞对转染HepG2细胞HBx信号转导的影响

五、共培养体系上清液干扰素水平的变化 在HBx转染的HepG2细胞与枯否细胞和TLR9激动剂共培养12h，与HBx转染组比，加入枯否细胞和TLR9激动剂后IFN-α和IFN-γ水平分别增加了8.7倍和6.5倍（P<0.05），而加入枯否细胞和TLR9激动剂Control则对IFN-α和IFN-γ的产生无显著性影响，见图6。

图6 共培养体系上清IFN-α和IFN-γ水平的变化比较

讨 论

HBV感染和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生有关。HBV感染者发生HCC的危险性是无感染者的200多倍[5]。HBx基因是HBV复制所必需的基因，在乙型肝炎慢性化和HCC的发生中具有重要的作用。HBx蛋白是一种反式激活因子，其本身不能与双链DNA直接结合，而是通过调控基因表达和蛋白间相互作用，激活多条细胞信号转导通路，如HIF-1α、NF-κB、AP-1、SP1 和 oct-1 等多种核转录因子，影响细胞的增殖、分化和凋亡，促进其恶性转化[6]。因此，干扰HBx蛋白信号转导功能对防治HBV相关性肝癌的发生具有重要意义。

TLRs受体是近年来发现的重要模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），是介导天然免疫与适应性免疫的桥梁[7]。CpG能够激活TLR9信号通路，并诱导机体产生抗病原体感染和抑制肿瘤细胞增殖等多种免疫效应[8]。近期研究发现，CpG对HCC的增殖与转移具有一定的抑制作用[2]，但CpG具体的作用机制尚不清楚。本实验结果显示，当CpG作用于KC细胞后，能够显著地抑制HBx蛋白介导的NF-κB信号通路的活化。KC细胞是肝脏内最重要的免疫细胞，是组织巨噬细胞中最大的群体。CpG激活KC细胞能够产生多种细胞因子，如干扰素、白介素12（IL-12）和肿瘤坏死因子（TNF-α）等[9]。其中，IFN 是抑制病毒感染的重要效应分子。本研究发现CpG激活KC细胞能够诱导IFN-α和IFN-γ的大量分泌，后者可能干扰了HBx信号的转导，最终影响到肝脏肿瘤细胞的增殖与恶化。

Van等研究发现，KC细胞在抑制肝脏肿瘤方面具有潜在的利用价值，CpG能够激活KC细胞，诱导产生大量的IFN-α等效应分子，从而在肝脏局部产生高浓度的IFN-α微环境，显著抑制HBx蛋白介导的多种信号通路的活化[10，11]，与本研究结果相符。因此，本研究为通过阻断HBx信号转导途径治疗肝癌提供了实验依据。

[1]杨光，杨亮，包木胜，等.新型CpGODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用[J].中国免疫学杂志，2009，（7）：60-63.

[2]CHEN J，XU W，ZHOU T，et al.Inhibitory role of tolllike receptors agonists in Plasmodium yoelii liver stage development[J].Parasite Immunol，2009，31（8）：466-473.

[3]BERTIN S，ANJUERE F，GAVELLI A，et al.Plasmidic CpG sequences induce tumor microenvironment modifications in a rat liver metastasis model[J].Int J Mol Med，2008，21（3）：309-315.

[4]严茂林，王耀东，田毅峰，等.小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨[J]. 福建医科大学学报，2008，42（6）：526-528.

[5]王郁杰.pCMV-tag2B—HBX质粒的构建和表达[J].内科，2008，3（3）：326-328.

[6]孙长宇，张贤强，杨观瑞，等.HBX蛋白、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶-9在肝细胞癌组织中的表达及意义[J].山东医药，2008，48（48）：6-8.

[7]董宁，姚咏明.Toll样受体免疫学研究新进展[J].感染炎症修复，2008，9（3）：34-36.

[8]SHARMA S，DOMINGGUEZ AL，MANRIQUE SZ，et al.Systemic targeting of CpG-ODN to the tumor microenvironment with anti-neu-CpG hybrid molecule and T regulatory cell depletion induces memory responses in BALB-neuT tolerant mice[J].Cancer Res，2008，68（18）：7530-7540.

[9]KAWABATA T，KINOSHITA M，INATSU A，et al.Functional alterations of liver innate immunity of mice with aging in response to CpG-oligodeoxynucleotide[J].Hepatology，2008，48（5）：1586-1597.

[10]VAN DER BIJ GJ，OOSTERLING SJ，MEIJER S，et al.Therapeutic potential of Kupffer cells in prevention of liver metastases outgrowth[J].Immunobiology，2005，210（2-4）：259-265.

[11]OHATA K，ICHIKAWA T，NAKAO K，et al.Interferon alpha inhibits the nuclear factor kappa B activation triggered by X gene product of hepatitis B virus in human hepatoma cells[J].FEBS Lett，2003，553（3）：304-308.