凝乳酶的研究进展

朱仁俊，石振兴，甘伯中，胡永金

（1.云南农业大学 食品科技学院，昆明 650201；2.甘肃农业大学 食品与科学技术学院，兰州 730070）

凝乳酶的研究进展

朱仁俊1，石振兴1，甘伯中2，胡永金1

（1.云南农业大学 食品科技学院，昆明 650201；2.甘肃农业大学 食品与科学技术学院，兰州 730070）

介绍了凝乳酶的来源结构、理化特性及凝乳机理，对提高微生物源凝乳酶的活力、产量的研究进展及未来凝乳酶研究领域的开发进行了综述，并对其应用前景和开发进行展望。

凝乳酶；干酪；凝乳活力；蛋白分解力

0 引 言

凝乳酶是干酪生产中使乳液凝固的关键性酶。它对干酪的质构形成及特有风味的形成有非常重要的作用[1]。目前国际市场上凝乳酶中动物来源的约占70%，微生物的占30%，植物的不到1%，虽然动物凝乳酶凝活力与蛋白水解能力的比值高，但是动物生长缓慢且价格昂贵；植物凝乳酶蛋白水解能力强，其生产也受时间、地域等条件制约，利用微生物生产凝乳酶成本低，生产能力可以不受限制地扩大，国外一些公司早已利用改良菌种生产出高活力的凝乳酶，创造了巨大的经济效益。我国自80年代末开展了凝乳酶的研究，但目前，国内大部分凝乳酶仍依赖于进口。当前优先发展的高科技产业化重点领域中，凝乳酶被列为我国重点开发的酶制剂之一[3]。

1 凝乳酶的来源

1.1 动物源凝乳酶

动物性凝乳酶主要是胃蛋白酶。直到20世纪末，人们一直使用小牛的皱胃进行凝乳酶的加工，但以宰杀小牛获得凝乳酶无法满足工业生产的需要，而且成本较高，为此，人们开发了多种皱胃酶的替代品。除可在小牛胃中提取凝乳酶外，猪、羊、狗的胃中也可以提取凝乳酶[4]。张富新等[5]研究了不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的影响。但羔羊皱胃酶凝乳性较低，影响了它的使用价值。刘文宗等[6]实验研究证明用乳猪胃酶替代小牛皱胃酶是可行的，且效果不错。水生动物中也能提取凝乳酶制剂,如鳖鱼能以酶原的形式分泌酸性蛋白酶，其胃粘液中的蛋白酶具有凝乳活性[7]。Haard[8]从海豹的胃和胃粘液中提取一种蛋白酶，这种酶在pH值为6.0～6.8范围内有很好的凝乳活性，制造出的Cheddar干酪风味正常，是一种很有潜力的皱胃酶替代品。Tavares等人[9]报道：从金枪鱼胃黏膜中提取出来的粗胃蛋白酶可作为凝乳酶的代用品，该酶来源广泛，因此价格低廉，是一种较好的凝乳酶代用品。尽管如此，但由于动物资源不如植物和微生物丰富，各国学者纷纷将研究目标转向植物和微生物源凝乳酶。

1.2 植物源凝乳酶酶

许多植物来源的蛋白酶具有凝乳的性质，植物凝乳酶来源广泛，己知木瓜、无花果、菠萝、南瓜、合欢树、银杏等植物中都含有能使乳凝固的蛋白酶。其中对无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、波萝酶研究最为广泛。张富新等人[10]对无花果蛋白酶的凝乳特性进行了研究，发现其有较好的凝乳性。但许多研究表明植物性凝乳酶蛋白水解活力高，在加工干酪时影响其风味和产量，并且受时间、地域、生长周期长等条件限制，难以发展[11]。

1.3 微生物源凝乳酶

微生物凝乳酶是目前最有前途的发展方向。微生物生长周期短，产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低、酶提取方便、经济效益高[11]。微生物凝乳酶可以划分为霉菌、细菌、担子菌3种来源的制剂。生产中应用最多的是来源于霉菌的凝乳酶，其代表物是从微小霉菌（mucorpusillus）中分离出来的凝乳酶，分子质量为29800 u，凝乳的最适温度为56℃，蛋白分解力比皱胃酶强，但较其他蛋白酶的蛋白分解能力弱，对牛乳的凝固作用较强[3]。郭光远等[12]人从2127株放线菌筛选的初步结果表明，62%的高温链霉菌菌株产生凝乳酶，产酶活力较高（100U／mL）的菌株占5.2%：中温链霉菌有11.3%的菌株产酶，活性较高的占2.2%。小单孢菌、诺卡氏菌、马拉杜放线菌、高温放线菌也都有产凝乳酶的活力。对215株真菌的筛选结果表明，有9.8%的菌株产生凝乳酶。细菌有8.8%的菌株产凝乳酶，活性较高的占3.1%[11]。孙健等[13]从17株产凝乳酶的霉菌中初筛到产酶最较高的总状毛霉（Mucor racemosus）菌株。刘振民等[14]发现酒药中的主要菌系-根霉，具有一定的产凝乳酶活力，可作为凝乳酶的潜在生产菌。目前微生物凝乳酶应用最多的是微小毛霉（Mucor pusillus）产生的凝乳酶。微小毛霉凝乳酶的蛋白分解力比皱胃强，但比其它的蛋白酶蛋白分解力弱，对牛乳凝固力强。钱世均等[15]人从19株毛霉中筛选出一株微小毛霉菌株，并对其产生的凝乳酶进行了纯化和酶学性质的研究。

2 凝乳酶结构、理化特性及凝乳机理

2.1 凝乳酶的结构及理化特性

凝乳酶原分子量为40，777u（365个氨基酸），在酸性条件下N末端的42个氨基酸能够自我剪切掉，形成分子量为35，622 Da（323个氨基酸）有活性的成熟凝乳酶。凝乳酶蛋白为肾形，大小为49Å×50Å×65Å。它具有酸性蛋白酶家族的类二折叠对称的结构特点，与其他真核细胞天冬氨酸蛋白酶有高度的同源性，变异范围在30%～60%之间。通过X线衍射研究发现：凝乳酶分子可分为由1～175氨基酸残基组成的N端区域和由176～323氨基酸残基组成的C端区域，两个区域之间是一个深沟状的活性部位[16]。凝乳酶以β片层结构为主，每个区域的β结构都由正向平行和反向平行的β折叠组成。每个部分都有一些α螺旋的短片段与β折叠相连，通常一个区域内的β折叠在另一个区域有局部相同的片段，而α螺旋则没有。在N端区域和C端区域的分离裂沟底部发现两个天冬氨基酸活性位点：Asp-34和Asp-216。氨基酸残基和水分子在活性位点形成广泛的氢键网状结构以维持凝乳酶的类二折叠对称结构。二硫键Cys-250和Cys一283对于酶的活性有重要意义，如果将这两个二硫键羧基化或汞化，可使酶活性降低25%。凝乳酶等电点为pH值为4.5。干燥物活性稳定，但水溶液不稳定，水溶液的pH值约为5.8，对牛奶凝固的最适pH值为5.8，最适温度为37-43℃，在15℃以下和55℃以上时不呈活性。几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚。凝乳酶以两个等位基因A和B的其中一种形式表达，A的244位点为Asp，而B为Gly，凝乳酶A和B活性的不同归因于Asp244的强电子活性导致的键亲和力增加[17]。凝乳酶A对K-酪蛋白有更强的活性，但比凝乳酶B缺少稳定性。凝乳酶C是凝乳酶A的自溶产物，由凝乳酶A自行切除Asp286-Glu287-Phe288而产生C[18]。

2.2 凝乳酶的凝乳机理

凝乳酶凝乳过程可分为两步：第一步是酶专一性地水解乳中酪蛋白多肽链的105～106位苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键，形成稳定的副酪蛋白及亲水性的糖巨肽；第二步是当总的酪蛋白被水解掉约85%时，在钙离子存在下通过在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块或凝固的乳[19]。这是由于酪蛋白的稳定性在于κ-酪蛋白分子层的存在，κ-酪蛋白分子位于酪蛋白胶束表面，亚基之间以疏水键和胶体磷酸钙相互作用的方式连接在一起。酪蛋白在凝乳酶的作用下，酪蛋白胶粒表面κ-酪蛋白分子层部分分解，胶粒内部的αs、β-酪蛋白失去胶体保护作用，变为副酪蛋白，而副酪蛋白在钙离子存在下，形成不溶性凝块。理想的凝乳酶应能迅速、专一地打开κ-酪蛋白的Phe105-Met106键，而水解其他肽键的蛋白水解能力低，即两者的活力比值要高[11]。

3 提高微生物源凝乳酶的活力及产量的研究进展

3.1 优化培养基及培养条件

在培养产凝乳酶微生物的过程中，主要研究集中在挑选凝乳活力较高而蛋白水解活力相对较低的产酶菌株。甘伯中等[20]对微生物凝乳酶固态发酵条件的研究中发现：培养基固液比为1︰0.8，产酶最适培养基为：麸皮10 g，水8 g，硝酸铵1 g氯化钙0.08 g；最佳产酶条件为28℃，接种量为10%，培养72 h，起始pH值为6.5，并得出微小毛霉诱变菌株HL-1可高效产凝乳酶[19]。周俊清[19]在凝乳酶优良菌株的选诱及其酶活特性的研究中发现，经诱变后的菌株UH-19液体摇瓶发酵的最佳培养基配方：鼓皮9%，乳清粉1%，CaCl2为0.2%，NaH2PO4为0.43%，无水NaCO3为0.1%（均为质量分数）。培养发酵产酶的最佳条件：种子菌龄为48 h，温度为30℃，发酵48 h，培养液起始的pH值为7.0，摇床转速为180 r/min。孙健等[13]对变异后的总状毛霉R132进行了产酶最优条件的探讨，发现R132株适于液体培养产生凝乳酶；对培养基有机成分进行了L9（34）的正交试验，结果证明葡萄糖为显著因子，麸皮次之，奶粉与豆粉显示较弱的负效应。选出了优化的培养基配方：麸皮4%， 葡萄糖6%，NaNO30.3%，KH2PO40.05%，Mg-SO40.025%（均为质量分数）；在此培养条件下，酶活性比值有较大提高。郭光远等[12]研究了菌株Y85一8512的发酵条件与产酶关系，认为液体种子10%的接种量发酵72 h酶活力最高。刘振民等[14]在对酒药中凝乳酶菌株筛选及产酶条件的研究中得出：土豆汁培养基有利于酶的产生，酶活可达11.08U/mL。

3.2 诱变育种

大多数野生菌株产凝乳酶活力较低，产生的酶蛋白水解力也比较高，不适合工业化生产。因此可通过对菌株有目的地进行人工诱变，提高突变频率，迅速获得优良高产的菌种，从而产生巨大的经济效益[11]。在对产凝乳酶菌株的诱变育种方面，有不少学者做了大量的研究，以获得产凝乳酶活力高和蛋白水解力低的菌株。郭光远等[12]对56株酶活力超过l00 u/ml的菌株进行反复对比后，选定一株毛霉（Mucor sp.）代号Y85-8512和一株芽抱杆菌（Bacillus sp.）代号Y85-8501作出发菌，经诱变选育得到酶活比值高且凝乳活力分别可达到5000 U/g和l0000 U/g的稳定高产菌株。周俊清等[19]在凝乳酶优良菌株的选诱及其酶活特性的研究中以细菌BZ-17为出发菌株，通过诱变筛选出一株变异菌株UH-9，该菌株所产酶与出发菌株相比，凝乳活力提高279.32%，蛋白水解活力降低了80.88%，并经过5代遗传稳定性试验表明该菌株所产酶的活力可保持在稳定的水平。矫庆华等[21]人研究认为，微小毛霉602在含有50%～60%麸皮的半固体培养基中，起始pH值为5.0～6.7，28℃条件下培养96 h，所产生的酶具有较高凝乳活性和较低的蛋白水解力，补加葡萄糖、蔗糖、硫酸馁、乳清粉均对产酶无显著的影响。利用诱变育种，可获得产高效凝乳酶的菌株，但此法随机性和盲目性较大，工作也较繁锁，结果难以预测，若结合现代统计分析软件和技术，合理设计实验，将会大量减少工作量，取得较理想的结果。

3.3 基因工程育种

基因工程育种是把某一生物体的遗传物质在体外经限制性内切酶与连接酶剪接，与一定载体（质粒、病毒等）相连接，构成重组DNA分子，通过一定的方法转入另一生物体（受体）细胞中，使被导入的外源DNA片段在受体中表达，并稳定遗传[19]。基因工程育种是当今最重要也是人们研究最多的高新生物技术之一，与诱变育种技术相比，它是人们在生物学指导下可预先设计和控制的育种新技术使试验向预定的方向进行，减少了传统育种的随机性和盲目性[22]。克氏乳酸菌具有良好的发酵属性，Madzak等[23]用XPR2启动子调控前凝乳酶基因的表达，其活性凝乳酶的产量明显高于由Y脂肪分解酶启动子调控的凝乳酶表达的产量。霉菌中比较适合转入凝乳酶基因的霉菌是米黑氏毛霉菌，不斯理毛霉菌，寄生毛霉菌和黑曲霉。Tsuchiya等[24]发现用米曲霉作为牛凝乳酶源表达载体具有高效表达异源性蛋白质的特点。Tsuchiya构建了PEG31、PFG33两种质粒：以Cla-A作启动子的PFG31质粒带有Gla-A-1-633Aaa基因， 缺C端9个Aa基因PFG33质粒带Gla-A-1-511Aa基因，缺糖结合位点，从这两种质粒在米曲霉中表达情况的研究中发现F316菌株 （含PFG33质粒）产凝乳酶原量最高。Cardoza和Gutierrez构建了两种重组质粒，一种将3-磷酸甘油醛脱氢酶（gpdA）调控基因与前凝乳酶源基因构建在一起，另一种将曲霉菌胃蛋白酶B（pepB）调控基因与凝乳酶源基因构建在一起，将它们分别转化黑曲霉菌（A.awamori）,发现黑曲霉的两种质粒转化子都能分泌牛凝乳酶，而且无论是酶的活性还是抗原性都是一致的[25]。

用大肠杆菌生产重组凝乳酶，通过质粒构建、加强质粒稳定性、选择合适菌株、改善培养基成分和生长温度等来提高产量.已经取得了很多进展。Mohanty等[17]分别将Lac调控基因和Trp-beta调控基因与前凝乳酶基因构建在一起，使凝乳酶能在大肠杆菌中表达，但重组蛋白以细胞内包含体形式存在，需在下游操作中进行变形、复性的处理。王志林等[26]通过设计一对特异性引物，采用RT-PCR技术从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因，并将其重组到pPIC9K载体中，转化大肠杆菌并筛选阳性克隆，得到的基因为木瓜凝乳酶基因。

3.4 蛋白质工程育种

蛋白质工程这一技术是编码蛋白质的基因DNA碱基排列顺序或蛋白质的氨基酸序列顺序或蛋白质的氨基酸序列完全清楚的基础上进行的。天然的凝乳酶由于具有凝乳活力低，蛋白水解能力强等一些缺陷，在生产实践上的应用受到很大制约。因此，利用蛋白质工程对凝乳酶进行定向的分子改造，研究凝乳酶分子中特定氨基酸残基与其功能之间的关系，通过基因定点突变技术可以实现酶分子中特定氨基酸残基的替换，通过替换前后两种酶蛋白质的比较就可以进一步阐明凝乳酶分子结构与其特定性质之间的确切关系，继而改善其相应的酶学性质。目前对凝乳酶结构方面的研究主要是复性过程中二硫键的重折叠问题。牛凝乳酶在复性过程中由于二硫键的正确折叠率、配对率较低，导致凝乳酶的表达率低。因此，设想通过蛋白质工程将牛凝乳酶的二硫键减少，以期提高复性率。Huang K等人[27]发现凝乳酶中Cys250-Cys283键是决定必需的，Cys45-Cys50是可取代的[28]，而Cys206-Cys210对凝乳酶的正确折叠不是必需的[29]。

弄清每对二硫键的功能与性质后，就可以利用蛋白质工程对凝乳酶在不改变其原有性质的基础上提高复性率，增加表达产量。同理，研究清楚凝乳酶蛋白质结构组成及一些酶学性质后，可对其进行结构改造，提高凝乳活力，降低蛋白水解力。然而这些工作还处于起步阶段,还有很多工作要做。随着研究工作的深入，相信高效的凝乳酶将有一个良好的发展前景[30]。

4 开发与展望

随着我国畜牧业的迅速发展，奶酪以其丰富的营养成分，并作为牛奶一种长期有效的保存方法，值得大力推广。虽然人们己经尝试了使用各种方法，提高凝乳酶活力，降低蛋白水解力并且取得了很大进步，但是仍有很多问题没有解决，尚需科学工作者付出艰辛的努力，不断探索、发现更好的方法和找到更好的途径获得高效的凝乳酶[11]。可以通过筛选出更多优良菌种，用该菌株生产的凝乳酶应有效凝乳而水解活力不大,并且用其制作的奶酪质地和风味易被消费者接受；积极利用现代生物技术对产酶菌种进行改良，开发新型酶，以及酶的反应技术，酶的应用等，使之更有利于食品工业的发展。对影响凝乳酶原表达的因素开展进一步的研究，以求发现更多更好的载体、宿主细胞，进而不断提高其表达率；利用固定化酶技术不失为解决凝乳酶短缺的有效途径。

为了使我国奶酪生产能顺利发展，解决凝乳酶的供应矛盾，对凝乳酶的研究及开发已成为乳品业当务之急，这方面的研究必然成为今后奶酪工业化生产中一个研究的热点和难点，而且也将给社会带来巨大的经济效益。

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Rearch advancement of Chymosin

ZHU Re-jun1,SHI Zheng-xing1,GAN Bo-zhong2,HU Yong-jin1
（1.Yunnan Agricultural University，College of Food Science and Technology,Kunming 650201,China；2.Gansu Agricultural University，College of Food Science and Technology,Lanzhou 730070，China）

This article describes the resource,structural composition,general characteristics,and mechanism of chymosin and overview research progression about research and prospect of chymosin in future and how to enhance clotting milk activity and production of the microbial source chymosin.Furthermore,the prospect of chymosin application was also predicted.

Chymosin;cheese;clotting milk activity;protein decomposition power

TS252.1

B

1001-2230（2010）01-0039-04

2009-08-24

甘肃省农业生物技术专项 （GNSW-2006-14），甘肃省科技重大专项 （0702NKDA034）。

朱仁俊（1968-），男，副教授，主要从事食品科学与工程的研究。

胡永金