从WPC中分离β-lactoglobulin的方法

段翠翠，霍贵成，任大喜，冯芳菲

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

从WPC中分离β-lactoglobulin的方法

段翠翠，霍贵成，任大喜，冯芳菲

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

β-Lactoglobulin是乳清中的主要蛋白，已经有很多方法应用于分离提取β-Lg，但是这些方法或技术大多数比较贵或有时候比较复杂，不能够达到足够的产量或纯度。介绍一种简便易行，重复性强，低成本的方法从浓缩乳清蛋白（WPC）中分离β-Lg，并且利用BCA法测定蛋白的质量浓度表明提取β-Lg的质量浓度很高，而SDS-PAGE表明提取的β-Lg有较高的纯度。

蛋白纯化；β-lactoglobulin；BCA；SDS-PAGE

0 引 言

乳清蛋白中的主要蛋白β-Lg是特征最明显的牛乳蛋白之一。其在乳清中的质量浓度约为3.2～3.4 g/L。人们基于不同的目的来分离β-Lg，因为其具有优良的营养价值和功能性质。如果能控制分离成本，天然β-Lg有望成为非常实用的食品添加剂[1]。

已经有很多技术被用于分离和/或提纯牛乳中的各种蛋白，例如，盐析[2，3]，在质量分数为3%的三氯乙酸（TCA）条件下选择性提取β-Lg[4]，阳离子交换色谱[5-6]，高效液相色谱（HPLC）[7，8]，快速蛋白液相色谱（FPLC）以及其他的色谱技术[9,10]和等电点聚焦[11]。但是这些方法大多数比较贵或比较复杂。此研究的目的是开发一种简便，易行，低成本的方式从WPC（浓缩乳清蛋白，80%）中分离β-Lg（分子量为18.3 ku）。本研究是参考文献[12]中的方法，然后进行了改进。

1 实 验

1.1 蛋白分离纯化系统

AKTA，美国UVP凝胶成像系统（UPLAND），CA91786 USA，酶标仪（型号680），SDS，蛋白质标样，Bio-RAd电泳仪（型号PowerPac Basic），进口浓缩乳清蛋白粉（WPC，质量分数80%），BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型），碧云天；96孔细胞培养板，PBS溶液，标样为抑肽酶，链霉素，β-乳球蛋白标准品，α-乳白蛋白标准品，低分子量蛋白标准品。

1.2 电泳所用试剂

质量分数为30%丙烯酰胺（Acr），质量分数为10%SDS（十二烷基磺酸钠），浓度为1.5 mol/L的Trisbase缓冲液，pH值为8.8浓度为0.5 mol/L的Tris–base缓冲液，pH值为6.8质量分数为10%过硫酸铵，TEMED（四甲基乙二胺）。样品缓冲液：去离子水15 mL，浓度为0.5 mol/L的Tris-HCl，pH值为6.8，25 mL，50%的甘油，20 mL，质量浓度为100 g/L的SDS 40 mL；质量浓度为1 g/L的溴酚蓝、电泳缓冲液为3.03g的Tris，14.41 g甘氨酸，1 g的SDS，加水溶解至1L；染色液为0.5 g考马斯亮蓝G-250，250 ml甲醇，34 ml的冰醋酸，加水至500 mL；脱色液为75 mL冰醋酸，50 mL的甲醇，加水至1L；封存液：异丁醇；配置溶液用的水都为去离子水。

2 方 法

2.1 β-Lg的分离提取

2.1.1 酪蛋白和乳清蛋白的分离

首先用浓度为1 mol/L的HCl调节一定质量分数（10%）的WPC溶液，使其达到酪蛋白的等电点，pH值为4.6，在此pH值条件下酪蛋白和乳清蛋白分离[13]，然后以5 000 r/min转离心20 min，收集上清液，其主要是乳清蛋白。这一步主要是去除WPC中混有的酪蛋白组分，为使去除效果较好，将上清液再离心，取上清，重复操作3次。

2.1.2 α-La和β-Lg的分离

将第一步获得的上清液用浓度为1 mol/L的NaOH调节pH值至7.5，根据Mailliart&Ribadeau-Dumas[14]，用质量分数为7%的NaCl浓度为6 mol/L的HCl调节pH值至2，使β-Lg，α-La和BSA分离。 用转速为8 000 r/min离心20 min后，在上清液中回收β-Lg，沉淀中包含浓缩的组分α-La和BSA。用质量分数为6%的NaU（pH值为2）的溶液冲洗沉淀去除沉淀中的大多数β-Lg，然后再离心，重复操作3次。随着在上清液中不断增加NaU的质量分数，β-Lg被盐析出来。在pH值为2，NaCl质量分数为30%的时候，出现β-Lg沉淀，然后用8 000 r/min转速离心20 min，将上清液倒掉，沉淀中主要是β-Lg。调节pH值为7将两种沉淀物溶解在最少量的水中，透析，然后冻干。

2.2 蛋白分离纯化进一步提纯

将冻干后的样品溶解在少量水中，进行蛋白分离纯化，分离纯化所使用的柱子是Superdex_75_10/300_GL，将样品峰和标样峰做对比，选择样品峰中和标样峰中的β-Lg出峰时间或者出峰体积一致的峰，收集此峰，即是纯化后的β-Lg。将收集好的β-Lg冻干浓缩体积。

2.3 脱盐

经过上述分离纯化，然后冻干后的β-Lg中，因为洗脱液是浓度为0.05 mol/L的乙酸钠和浓度为0.1 mol/L的氯化钠，其中含有大量的盐类，所以对其脱盐这一步骤是必不可少的，根据洗脱顺序，首先流出来的是β-Lg，然后是电导峰，收集电导峰出来之前的β-Lg。将收集后的β-Lg再冻干。得到的即是比较纯的β-Lg。

2.4 BCA法测定蛋白质量浓度

将分离纯化后的样品使用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒（增强型）测定所得β-Lg的质量浓度。将20 μL质量浓度为1 g/L的粗β-Lg加入96孔板中，设3个重复孔，然后每孔加入200 μL工作试剂，于60℃温育30 min，于酶标仪570nm波长处读取吸光值。用试剂盒中的BCA蛋白标准溶液作标准工作曲线，BCA法标准工作曲线的具体操作是：将标准蛋白配制成质量浓度为0.5 g/L的溶液，然后按体积为0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL，质量浓度分别为0，0.025，0.5，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L的系列标准工作溶液，按BCA试剂盒说明书测定，根据统计测定结果得到线性回归方程为y=0.7821x+0.0838，相关系数R2=0.9957（见图1）。

图1 BCA标准曲线

2.5 SDS-PAGE分析蛋白的纯度

（1）制备分离胶和浓缩胶：分离胶的质量分数为12%。

（2）样品制备：将样品配置成一定质量浓度的溶液（2 g/L），然后和样品缓冲液按1︰1混合，按体积分数为10%的比例加入巯基乙醇，将样品煮沸3 min，备用。

（3）电泳：将样品加入制好的胶内，上样量为10μL，分子量范围为14.4～97.4 ku。80 V恒压，当电泳条带跑出浓缩胶和分离胶分界面后110 V恒压。

（4）染色、脱色。将跑好的胶放入制好的染色液中，染色2 h，倒掉染色液，用PBS冲洗两次，然后加入脱色液，每隔2 h更换1次脱色液，直至条带清晰，约需12 h。

3 结果与讨论

3.1 根据蛋白分离纯化峰收集β-Lg

图2为β-Lg的样品峰；图3为标样峰。由图2和图3可以看出，对应标样峰中的出峰体积，可以确定此峰为β-Lg的峰，而且此峰周围几乎没有杂峰，便于收集。收集此峰，然后将收集的样品进行冷冻干燥，这一步是为了浓缩，然后进行脱盐。

3.2 脱盐

图4为β-Lg的脱盐峰。图4中，左峰是对应的β-Lg的峰，右边的电导峰对应的是盐类。由图4可以看出，所使用的脱盐柱子可以将β-Lg和盐完全分开，并且经过第一步以后β-Lg没有杂峰，是非常纯的。将脱盐后的样品再冷冻干燥，所得样品即为β-Lg的分离物。

图4 脱盐峰

3.3 BCA试剂盒测定的结果

将所测得的β-Lg平均读数0.642带入标准曲线的方程中，计算β-Lg的质量浓度为0.7137 g/L，根据β-Lg原样品质量浓度为1 g/L，可知其质量分数为71.37%。

3.4 SDS-PAGE分析蛋白纯度结果分析

图5为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图5中，左边为标准蛋白（marker），从上到下分别为兔磷酸化酶B（97.4 ku），牛血清白蛋白（66.2 ku），兔肌动蛋白（43.0 ku），牛碳酸酐酶（31.0 ku），胰蛋白酶抑制剂（20.1 ku），鸡蛋清溶菌酶（14.4 ku）；右边为β-Lg。

由图5可以看出，此方法所提取的β-Lg是非常纯的，没有杂峰，由此也知道上面BCA方法测定的蛋白中，质量分数为71.37%，剩余的物质基本是分离纯化后的盐类，杂蛋白很少，可以忽略。

4 结 论

本研究介绍了一种简单的方法从WPC中提取β-Lg，并用蛋白分离纯化将粗提的β-Lg进一步提纯，然后脱盐冻干，得到的即是比较纯的β-Lg。然后是利用BCA法测定蛋白质量浓度，又利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测β-Lg的纯度。

传统的方法是[15]：将鲜牛乳离心去除脂肪，下层即为脱脂乳；然后凝乳，等电点沉淀法去除酪蛋白；最后是盐析，用硫酸按盐析法按饱和度将乳清蛋白沉淀下来，再将盐析后的乳清蛋白透析，然后再除盐。此方法的缺点是操作比较粗，提取出来的β-Lg纯度不够，杂蛋白质量浓度高，而且大家用凯式定氮法测量蛋白质量浓度，由于其使用了硫酸铵，所测得的含氮量会偏高。

本文根据分离纯化标样中对应分子量的峰确定粗提的β-Lg中所要收集的峰，这一步可以使粗提的β-Lg进一步纯化，脱盐过程又使得纯化β-Lg中的盐类降到最低，这两个步骤使得最终的β-Lg纯度达到最高。

利用BCA法测定上述步骤中得到的β-Lg中的蛋白质量浓度，根据标准曲线计算其结果为713.7g/L，此值说明蛋白质量浓度较高，此方法是一种纯度非常高的β-Lg分离方法。

从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果可以看出，经过分离纯化后的β-Lg的电泳条带只有18.3 ku处的一条带，没有其他的杂带，说明β-Lg纯度非常高。

综合本研究的实验结果可以看出，本实验使用的提取方法，能够提取出纯度非常高的β-Lg，而且操作简单，所需的仪器药品都是常规使用的，价格都不高，所以成本比较低，适合一般实验室进行中小规模的分离提取。

[1]HORTON B.Wheys of Recovery[J].Dairy Industry International,1996,61（5）：39-40.

[2]MAILLIART P,RIBADEAU-DUMAS B.Preparation of B-Lactoglobulin and B-Lactoglobulin Free Proteins from Whey Retentate by NaCl Salting Out at Low Ph[J].Journal of Food Science,1988，53：743-745.

[3]MATE H J,KROCHTA J M.B-Lactoglobulin Separation from Whey Protein Isolate on a Large-Scale[J].Journal of Food Science,1994，59：1111-1114.

[4]CAESSENS,P W J R,VISSER,S,GRUPPEN H.Method for the Isolation of Bovine B-Lactoglobulin From a Cheese Whey Protein Fraction and Physicochemical Characterization of the Purified Product[J].International Dairy Journal,1997，7：229-35.

[5]OUTINEN,TOSSAVAINEN,，SYYÄOJA.Chromatographic Fractionation of A-Lactalbumin and B-Lactoglobulin with Polystyrenic Strongly Basic Anion Exchange Resins[J].Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie,1996，29：340-343.

[6]KRISTIANSEN K R,OTTE J,IPSEN,R,et al.Large-Scale Preparation of B-Lactoglobulin a and B by Ultrafiltration and Ion-Exchange Chromatography[J].International Dairy Journal,1998，7：805-812.

[7]BOBE G,BEITZ D C,FREEMAN A E,et al.,Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography[J].J Agric Food Chem，1998，46：458–463.

[8]BORDIN G,CORDEIRO F，RAPOSO B，et al.Identification and Quantification of Major Bovine Milk Proteins by Liquid Chromatography[J].J Chromatogr，2001，928：63-76.

[9]B MANJI,A HILL,Y KAKUDA,DM IRVINE,Rapid Separation Of Milk Whey Proteins By Anion Exchange Chromatography,J.Dairy Sci.1985，68：3176-3179.

[10]SK BASAK,A VELAYUDHAN,K KOHLMANN,et al.,ElectrochromatographicSeparationOfProteins,J.Chromatogr.A 1995，707：69-76.

[11]GODOVAC-ZIMMERMANN J,KLOSTERMEYER H,Isolation And Rapid Sequence Characterization Of Two Novel Bovine BLactoglobulins I And J[J].J Protein Chem，1996，15：743-750.

[12]WAL J M,BERNARD H,YVON M,et al.Enzyme Immunoassay of Specific Human IgE to Purified Cow’s Milk Allergens[J].Food&Agricultural Immunology,1995，7：175-187.

[13]ROWLAND S J.The Protein Distribution in Normal and Abnormal Milk[J].Journal of Dairy Research,1938，9：47-57.

[14]MAILLIART P,RIBADEAU-DUMAS B.Preparation of B-Lactoglobulin and B-Lactoglobulin Free Proteins from Whey Retentate By NaCl Salting Out at Low pH[J].Journal of Food Science,1988，53：743-745.

[16]乔秉善.变态反应学实验技术[M].北京：中国协和医科大学出版社，2002：98-100.

Separation β-lactoglobulin from WPC

DUAN Cui-cui,HUO Gui-cheng,REN Da-xi,FENG Fang-fei
（Key Lab of Dairy Science,Education Ministry，Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

β-Lactoglobulin（β-Lg）is the major protein in whey,several methods for isolating β-Lg have been described.However,none of the existing processes or techniques has been effectively implemented to achieve inadequate yield/purification.The aim of this study was to introduce a simple,reproducible,and less expensive method to isolate β-Lactoglobulin from whey protein concentrate.Moreover,the use of BCA protein concentration determination shows that the concentration of extracted β-Lg is very high,while the SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）result shows that the extracted β-lg has a high purity.

protein purification；β-Lactoglobulin；SDS-PAGE

TS252～59

A

1001-2230（2010）01-0019-04

2009-05-17

东北农业大学生物乳业创新团队资助项目（CXT 007-2）。

段翠翠（1984-），女，硕士，从事食品科学方面的研究。

霍贵成