原生质体融合技术选育弱后酸化乳酸菌菌株的研究

罗红霞，陈志刚，黄彦芳，王芳，李春平，赵钢

（1.北京农业职业学院 食品与生物工程系，北京 102442；2.新疆农业大学 食品科学学院，乌鲁木齐 830052）

原生质体融合技术选育弱后酸化乳酸菌菌株的研究

罗红霞1，陈志刚2，黄彦芳1，王芳1，李春平1，赵钢1

（1.北京农业职业学院 食品与生物工程系，北京 102442；2.新疆农业大学 食品科学学院，乌鲁木齐 830052）

对新疆地方乳酸菌Lactobacillus bulgaricus LN1#进行原生质体融合，应用均匀设计的方法得到L.bulgaricus LN1#的原生质体制备条件：溶菌酶质量浓度为15.00 g/L，酶解细胞壁的时间为60 min，酶解温度为44℃。对原生质体进行灭活，致死率达到100%的条件：紫外线灭菌为120 s;高温为53℃,60 min。应用青霉素对融合子进行筛选，最终得到37℃培养时产乳酸量与出发菌株相同，10℃贮藏时，产乳酸量明显减少的目标菌株NO2#和NO3#。

乳酸杆菌；原生质融合；弱后酸化

0 引 言

乳酸菌发酵制备而成的酸乳，由于具有改善胃肠道功能、提高免疫能力、改善机体营养状况等特殊的生理功能而越来越受到消费者的欢迎。但由于乳酸菌在正常发酵结束后，贮存、运输、销售直至食用前这一过程菌体仍会生长繁殖，使pH值继续下降，出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降等后酸化现象[1]。因此，控制酸乳的后酸化，提高酸乳质量、延长保质期是目前急需解决的问题。

至今为止，诱变育种和细胞融合生物选育仍是世界各国行之有效的重要方法，以其在筛选优良菌株应用上的卓越成效而最受推崇。尤其发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是以诱变育种和生物选育方法获得的。诱变育种和细胞融合生物选育除了能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。

本研究以新疆牧民自制酸奶疙瘩中筛选的乳酸菌为出发菌株，采用细胞原生质融合技术对该乳酸菌菌株进行选育，选育在高温条件下产酸较强、低温条件下产酸较弱的菌株；以此菌株作为发酵剂，发酵得到的酸奶与对照组比较，后酸化时间延长了2-3 d。细胞原生质融合技术对新疆地方乳酸菌菌株的选育研究尚属首次，该实验参数和研究结果以期对未来新的乳酸菌菌株资源的开发利用提供有效地参考价值。

1 实 验

1.1 材料与仪器设备

乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LN1#），由本试验室从新疆牧民自制酸奶中筛选、保藏，如图1所示。

对照菌株：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus bulgaricus，6032）标准菌株购于中国工业微生物菌种保藏中心，用作本试验对照菌株。

紫外可见分光光度计（岛津2450）；酸度计（2003 Thermo Electron Corposition）； 离心机 （Gppendorf-Centrifuge 5804R）；医用洁净工作台；生化培养箱；恒温培养箱。一次性针头滤器（PALL）；数显气浴恒温振荡器；倒置显微镜。

培养基与溶液：脱脂乳培养基；MRS培养基；pH值为7.0的磷酸缓冲液；生理盐水；高渗缓冲液；原生质体稳定液（PB）；高渗再生培养基（固体/半固体）;溶菌酶。

1.2 方法

1.2.1 溶液配置

原生质体稳定液（PB）[2]：0.02M HEPES,pH值为7.0，添加浓度为1 mmol/L的MgCl2,质量分数为0.5%的明胶,浓度为0.3 mol/L棉籽糖或浓度为0.5 mol/L的乳糖。

溶菌酶溶液：用原生质体稳定液（PB）配制成一定质量浓度的溶菌酶溶液，用一次性无菌滤器过滤除菌。

高渗再生培养基[3-4]：半固体固体MRS培养基（不含Tween80）中添加2.5%的明胶，浓度为20 mmol/L的MgCl2，浓度为0.5 mol/L的蔗糖，质量分数为0.5%小牛血清。

聚乙二醇（PEG）6000：用原生质体稳定液（PB）配制成35%的溶液，115℃灭菌20 min。

1.2.2 菌种活化

取菌种LN1#按质量分数3%接种于脱脂乳培养基中，42℃恒温培养12 h。多次传代直至达到要求的活力。

1.2.3 生长曲线的测定

对菌种进行单因素实验，分别测定其最适生长温度、最适接种量、最适初始pH值。于最佳条件下测定菌株的生长曲线[5]。

pH值-采用pH211型酸度计；酸奶酸度采用吉尔涅尔度表示[6]；乳酸菌活菌数-采用高层琼脂法[7]；OD值的测量-采用紫外可见分光光度计测定，波长600 nm。

1.2.4 原生质体制备与再生

取对数生长期菌液10 mL，离心（3 000 r/min）并以原生质体稳定液（PB）洗涤两次，用原生质体稳定液（PB）稀释，转入10 cm培养皿中，加入一定质量体积的溶菌酶溶液，处理一定时间，应用裂解法和倒置显微镜观察（图2）法测定原生质体形成率。

图2 乳酸杆菌原生质体（未染色L：10×40）

分别取4 mL热力灭活和紫外先灭活的原生质体混合，放置5 min后离心，重悬于8 mL质量分数35%的PEG6000溶液中。37℃水浴保温2 min，离心，洗涤2次，重悬于8 mL原生质体稳定液中。取1 mL融合液稀释后，取0.1 mL加入到半固体高渗再生培养基中，转入灭菌培养皿中置37℃下培养直到长出菌落。

1.2.5 原生质制备条件的确定

根据单因素实验结果设计正交试验表1（如表1），通过均匀实验确定来原生质体制备的最佳条件。

表1 原生质体制备条件均匀设计实验水平因素

1.2.6 原生质体灭活

灭活原生质体的机理是：紫外线使菌株的DNA发生突变,热的作用可使细胞内有功能蛋白、酶蛋白变性失活。

高温灭活[8]：取上述制备两菌株原生质体混合液1/3于5 mL离心管中，置于53℃水浴中保温，不同时间取50 μL均匀分散于半固体高渗再生培养基中，37℃培养，7 d后观察结果。

紫外线灭活[9]：另取2/3上述原生质体液于9.0 cm灭菌平板中，置15W紫外灯下，距离为30 cm并不时吸取50 μL均匀分散于半固体高渗再生培养基中，37℃培养，7 d后观察结果。

2 结果与分析

2.1 菌株LN1#生长曲线测定

由图1可知，菌株在37℃，3%接种量，初始pH值为6.6的条件下培养，经过一个较短的延迟期后，菌株即进入对数生长期，15 h时菌体浓度达到最高峰，之后进入稳定期，菌体OD值基本保持不变。

供诱变处理的细菌一般要求处于对数生长期，此时菌体生长状态比较同步,容易变异,同时为了保证处理时具有一定的细胞浓度以增加可能变异的细胞总数，常选用对数生长中后期的细胞进行处理。因此，本研究选定诱变菌株培养时间为12 h。

2.2 原生质制备最佳条件的选择

根据实验水平，采用U8*（85）的均匀设计方案，实验方案及结果如表2所示。

图3 供试菌株LN1#生长曲线

表2 均匀设计及实验结果

利用Uniform Design Version 2.20软件对表2实验数据进行多元回归分析 （回归分析采用后退法,显著性水平α=0.05），得到原生质体制备率与酶浓度、酶处理温度、酶处理时间的多元一次回归方程为

回归方程显著性变量分析如表3所示。

表3 回归方程变量分析

分析各因素对回归的贡献率如表4所示。

表4 各因素对回归的贡献

方程偏回归系数分别为B1=1.12,B2=0.280,B3=0.369，可见各因素对酶解率%的影响为：酶浓度＞酶处理时间＞酶处理温度。

由回归方程可知：X1，X2，X3的系数为正,表明试验指标随因素的增加而增加,所以,在确定优化方案时,各因素的取值应偏上限,即酶质量浓度取15.00 g/L,酶处理温度取44℃;酶处理时间取60 min。将以上各值代入上述回归方程,得到酶解率最大值为99.6%,这一结果好于表4中的9个实验结果。对其进行验证试验，得到结果与计算结果相接近。因此得到原生质体制备最佳条件：酶质量浓度取15.00 g/L；酶处理温度取44℃；酶处理时间取60 min。

菌株条件致死标记的选择结果如表5和表6所示。

表5 UV对乳酸杆菌致死率的影响

表6 温度对乳酸杆菌致死率的影响致死率

2.3 原生质体融合效果

从原生质半固体再生培养基培养8 d后，将培养皿中长出的24个菌落用无菌牙签挑出，分别接入接入MRS液体培养基中传代培养。用24株菌株进行发酵产酸测定结果如图4所示。

图4 发酵6 h酸度测定结果

对发酵6 h酸度在75～85oT的8株菌株测定储藏性能，筛选到2株储藏性能好的菌株，目标菌株储藏性能如图5所示。

图56032 ，LN1#，N02#，N03#发酵乳10℃期间滴定酸度变化

酸奶的正常酸度为80.00oT，根据实际生产和销售以及消费者的接受程度，本研究以120.00oT作为后酸化的指标值。

由图5可以看出，发酵脱脂乳在10℃贮藏时，随贮藏时间的增加滴定酸度值都逐渐升高。试验中菌株6032与LN1#到第5天时已经发生后酸化（滴定酸度＞120oT），而菌株N02#与N03#在贮藏的第8天和第7天时发生后酸化。菌株N02#较LN1#的发酵脱脂乳在贮藏时间上延长了3 d，菌株N03#较LN1#的发酵脱脂乳在贮藏时间上延长了2 d。发酵结束后，由于发酵乳温度由37℃未能立刻降到10℃，所以在储藏第2 d时滴定酸度较储藏初始时刻有较大升高，储藏3 d后发酵乳温度达到10℃，滴定酸度升高趋势减慢，当发酵乳发生后酸化后由于自身产酸抑制乳酸菌的增殖，所以滴定酸度增长幅度较慢。

3 结 论

（1）对LN1#进行原生质融合，得到最佳参数：溶菌酶质量浓度为15.00 g/L，酶解细胞壁的时间为60 min，酶解温度为44℃。

（2）得到目标菌株N02#与N03#，两株菌在37℃培养时产乳酸量与出发菌株一样，而在10℃贮藏时，产乳酸量明显减少。

（3）用N02#与N03#发酵酸奶，测定酸奶在储藏期间的产酸量，结果表明，菌株N02#发酵脱脂乳产生后酸化的时间较LN1#延长了3 d，菌株N03#发酵脱脂乳较LN1#在贮藏时间上延长了2 d,有效地控制了酸奶后酸化。

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Screening of the weak postacidification lactobacillus strains using protolast fusion technology

LUO Hong-xia1,CHEN Zhi-gang2,HUANG Yan-fang1,WANG Fang1,LI Chun-ping1,ZHAO Gang1
（1.Food&Bioengineering Department,Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442，China;
2.College of Food Science,Xinjiang Agriucltural Univisity,Urumqi 830052,China）

Protolast fusion technology was used in Lactobacillus bulgaricus LN1#from Xingjiang to obtain the weak postacidification strains.Optimum preparation condition for protolast of L.bulgaricus LN1#was achieved using uniform design experiment,being cytoderm was zymohydrolysed with lysozyme concentration of 15.00 mg/mL at 44℃for 60 min.The following 100%inactivation condition for protolast was attained with ultraviolet radiation for 120 s or high-temperature sterilizing at 53℃for 60 min.Penicillin was used to screen the weak postacidification strains.L.bulgaricus NO2#and NO3#were elected as target strain,which have the same lactic acid production capacity with LN1#at 37℃，but less lactic acid production than at LN1#10℃.

Lactobacillus;Protoplast fusion;weak postacidification.

Q93-335

A

1001-2230（2010）01-0008-04

2009-07-16

北京市教委科技支撑项目（KM200800005001）。

罗红霞（1962-），女，教授，研究方向为畜产食品科学。