基于矿石纳米材料的DNA转化的机理初探及方法改进

谭海东，王磊，林金涛，赵宗保

中国科学院大连化学物理研究所生物技术部，大连 116023

微生物的 DNA转化方法是基因工程中的重要内容，目前对微生物转化主要有化学法和电转化法[1]。但这些转化方法，仍然存在许多缺点，比如感受态细胞准备时间长，处理过程容易导致细胞活性降低，处理后要有温育等过程。2001年，Yoshida等发表了一系列关于使用温石棉 (Chrysotile asbestos) 实现质粒对原核生物转化的有趣方法[2-5]，这种方法被命名为Yoshida效应。但是这种方法仍然有很多缺点：操作繁琐、利用的介质对人体致癌等。对该法的可靠性有很多质疑，限制了它的应用[6]，所以这种新颖的DNA转化法很少被其他科学家引用。

最近，这种方法又进一步被Wilharm等改进[6]。他们使用的一种价格便宜、资源丰富、对人类健康友好的矿石纳米材料海泡石 (Sepiolite) 作为介质，实现了对多种微生物的质粒转化。作者在本方法中使用的参数与 Yoshida等报道的一致，并根据后者的报道，提出了借助海泡石进行DNA转化的相同机制。问题是海泡石和温石棉属于不同的介质：前者没有生物活性，后者有一定的生物活性；前者对人体友好，而后者可以致癌等。因此，我们认为这种新的转化方法，可能会存在不同的DNA转化机制。Wilharm 等虽然对方法进行了改进，但该工作是以非常短的通讯形式报道，很多参数未优化。我们认为对这种转化机制的充分理解和对该试验参数的优化，会促进这种方法的推广和实现对特殊物种的DNA转化。为此，我们进行了本研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌种

pET15b质粒有本组保存。E. coli DH5α菌株购自北京鼎国生物技术有限公司。短乳酸杆菌Lactobacillus brevis AS 1.579购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

蛋白酶K、250 bp DNA marker购自TaKaRa公司大连分公司。200~300 bp的RNA从短乳酸杆菌AS 1.579提取，在本组保存。海泡石购自德国Kremer Pigmente有限公司 (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG，Hauptstr. 41−47DE 88317 Aichstetten，Germany)，产品编号 58945。溶菌酶、盐酸胍、十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)、苯酚和琼脂糖购自北京鼎国生物技术有限公司。其他培养基及生化试剂牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉、氯仿和异戊醇等均为分析醇，购自大连博诺生物化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 海泡石悬浮液和培养基的准备

海泡石悬浮液根据文献准备4%储存液[6]：海泡石121℃灭菌20 min；用去离子水配含200 mmol/L KCl，5 mmol/L HEPES缓冲液，用NaOH调pH到7.4，过膜除菌。最后配成5% (W/V) 海泡石储存液。另外配10×海泡石缓冲液 (2 mol/L KCl，50 mmol/L HEPES，7.4) 备用。

LB培养基：在950 mL去离子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，摇动容器直至溶解，用NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1 L。取200 mL，加入3 g琼脂粉。在120℃灭菌20 min。待温度降到50℃左右，加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，准备40个抗性平板。

MRS培养基的配制：1 L蒸馏水中溶解下列组分：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸三铵2 g，乙酸钠5 g，吐温80 1 mL，硫酸镁 200 mg，硫酸锰50 mg，用高压锅在121℃灭菌15 min，调pH到6.8。其中葡萄糖单独灭菌。

1.2.2 海泡石吸附pET15b试验及转化E. coli DH5α的试验

从于 37℃培养 20 h的新鲜平板中挑取一个E. coli DH5α单菌落，接种于10 mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。将该菌悬液以1∶100的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养3 h至OD600=0.5左右。将培养液转入离心管中,冰上放置10 min, 然后于4℃下4 000 r/min离心10 min。弃去上清，用预冷的海泡石缓冲液10 mL轻轻悬浮细胞，4℃下4 000 r/min离心10 min。最后用2 mL的海泡石缓冲液悬浮，置于冰上备用。

取40 μL pET15b溶液 (100 ng/μL)，加入10 μL的5% (W/V) 海泡石储存液，充分混合，取5 μL备用。剩余的溶液12 000 r/min离心30 s，用1 mL的海泡石缓冲液连续洗涤 2次。吸附结果用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

取备用的细胞50 μL，加入5 μL质粒饱和的海泡石 (海泡石终浓度为0.1%)，充分混合。取备用的细胞50 μL，加入1 μL洗涤后的海泡石 (海泡石终浓度为0.1%)，充分混合。将2种悬浮液加到2个LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均匀涂抹30 s，最后放在37℃培养过夜。

1.2.3 利用海泡石对pET15b转化E. coli DH5α的试验参数优化

海泡石缓冲液对DNA转化率的影响：取备用的细胞50 μL 2份，1份用LB洗涤细胞，另外1份仍然保留海泡石缓冲液。分别加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石储存液，充分混合。将2种悬浮液加到2个LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均匀涂平板30 s，最后放在37℃培养过夜。

细胞浓度对DNA转化率的影响：分别取备用的细胞500 μL、50 μL和5 μL，前者通过离心后用50 μL海泡石缓冲液悬浮，后者加入45 μL海泡石缓冲液悬浮，这样 3个样品的 OD600分别是 200、20和2。分别加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石储存液，充分混合。将3种悬浮液加到2个LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均匀涂平板30 s，最后放在37℃培养过夜。

海泡石的浓度对DNA转化率的影响：分别取备用的细胞50 μL 3份，分别配成海泡石终浓度为1%，0.1%和0.01%的混合液。分别加入10 ng pET15b充分混合。将3种悬浮液加到3个LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均匀涂平板30 s，最后放在37℃培养过夜。

涂板次数和预干处理对DNA转化率的影响：取备用的细胞50 μL 7份，分别加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石储存液，充分混合。将4份悬浮液加到4个LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板分别均匀涂抹10次、20次、40次和100次，最后放在37℃培养过夜。另外3份细胞，1份立即用玻璃板均匀涂平板30 s，第2份10 min后用玻璃板均匀涂平板30 s，第3份20 min后用玻璃板均匀涂平板30 s，最后放在37℃培养过夜。

1.2.4 利用海泡石对pET15b直接转化E. coli DH5α单菌落

取4℃存放1个月的E. coli DH5α单菌落，加入20 μL海泡石缓冲液，加入100 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石储存液，充分混合。将细胞悬浮液加到LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均匀涂平板30 s，最后放在37℃培养过夜。

1.2.5 短乳酸杆菌AS1.579小片段RNA的提取

为了获得短乳酸杆菌AS1.579小片段RNA，该加入100 μL 5 mol/L NaCl混匀，再加入80 μL的CTAB/NaCl混匀，65 ℃ 10 min。加入固体的盐酸胍至终浓度6 mol/L[10]，待细胞彻底裂解后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液 (25∶24∶1)，混匀，12 000 r/min离心5 min，取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min。12 000 r/min离心10 min。沉淀用 75%的乙醇洗涤，晾干，最后用20 μL TE溶解，取3 μL电泳检测。

1.2.6 小片段RNA对pET15b转化E. coli DH5α的影响

取1 μL 5% (W/V) 海泡石储存液，加入5 μL小片段的RNA提取液 (200 ng/μL)，充分混合，让海泡石饱和吸附RNA。加入10 ng pET15b和备用的细胞50 μL，充分混合。将细胞悬浮液加到LB氨苄青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均匀涂平板30 s，最后放在37℃培养过夜。并与不加小片段RNA的作对照。提取使用不加 RNAase的基因组提取方法，参考分子克隆实验指南[7]，并对此方法进行优化。简述如下：取单克隆短乳酸杆菌到10 mL MRS培养基中，200 r/min、37℃培养过夜。将过夜培养物按 1∶50接入 100 mL MRS中，200 r/min、37℃培养至OD600=0.5。10 000 r/min离心30 s，收集沉淀，使用500 mmol/L的EDTA洗涤3次，最后用2 mL的500 mmol/L EDTA悬浮，200 W微波处理1 min[8-9]。10 000 r/min离心30 s收集沉淀，取50 mg菌体用400 μL TE重悬于1.5 mL离心管中，加入终浓度为10 mg/mL溶菌酶，10 mmol/L的DTT，37℃保温1 h。加入50 μL蛋白酶K (10 mg/mL)，混匀，65℃，1 h。

2 结果

2.1 海泡石吸附pET15b试验

从图1可以看出，用pET15b饱和后的海泡石，经过海泡石缓冲液充分洗涤后的海泡石几乎检测不到DNA。此结果说明海泡石对质粒的pET15b吸附能力很弱，几乎看不到DNA吸附。用pET15b饱和的海泡石转化细胞，长出的克隆数远远高于洗涤后的海泡石转化数 (图2，16-17)。这些结果说明，利用海泡石实现质粒转化，有可能不是海泡石将DNA带入宿主内的，而是由海泡石在宿主表面产生的瞬间小孔，导致DNA的随机进入。

图1 1%琼脂糖凝胶电泳检测海泡石吸附pET15b能力Fig. 1 Analysis of 1% agarose electrophoresis for the ability of sepiolite absorbing pET15b. 1: pET15b; 2: the sepiolite absorbing pET15b saturatedly; 3: the sepiolite saturated with DNA was washed once; 4: the sepiolite saturated with DNA was washed two times.

图2 海泡石用于E. coli DH5αDNA转化的参数优化Fig. 2 Optimization of DNA transformation for E. coli DH5α based on sepiolite. 1−2: the effect of sepiolite buffer for transformation. 3−5: the cell concentration is OD600=200, 20 and 2 in sample 3, 4 and 5 respectively. 6−8: the percent content of sepiolite is 1%, 0.1% and 0.01% in sample 6, 7 and 8 respectively; 9−12: the circulating times are 10, 20, 40 and 100 in sample 9, 10, 11 and 12 respectively. 13−15: the pre-dry treatment is 0 min, 10 min and 20 min in sample 13, 14 and 15 respectively; 16−17: washing effect for transformation; 18−19: the effect of RNA treatment for transformation.

2.2 利用海泡石对pET15b转化E. coli DH5α的试验参数优化

2.2.1 缓冲液

试验结果表明，使用培养基转化率略高于使用海泡石缓冲液 (图2，1~2)。另外海泡石缓冲液配制和过膜除菌的操作繁琐，利用培养基悬浮细胞，将使转化变得更加直接。

2.2.2 细胞浓度

细胞浓度是决定转化率高低的重要参数，我们研究表明当细胞浓度在OD600=20时转化率最高 (图2，3~5)。不同于电转，细胞浓度越高转化率越高。这可能与海泡石物理运动空间需要有关，细胞浓度太高，海泡石纤维不能充分运动，限制了质粒对细胞的有效转化。

2.2.3 海泡石浓度

试验结果表明使用海泡石的浓度比报道的高了近10倍，而转化率有5倍以上增加 (图2，6~8)。我们认为使用0.1%的海泡石浓度，而不是0.01%，转化率会更高些。具体原因不很清楚，是否由于不同批次产品之间存在纳米纤维材料数量的差异。

2.2.4 涂平板次数和状态

菌液不经预干处理，直接涂抹平板，随着涂抹次数的增加，转化率逐渐增加 (图2，9~12)。另外，随着预干处理时间的延长，转化率会逐渐降低 (图2，13~15)。

2.3 利用海泡石对pET15b直接转化E. coli DH5α单菌落

在 4℃储存 1个月的单菌落，利用海泡石仍然可以实现质粒的转化。取 4℃储存 1个月的单菌落，利用海泡石直接转化，转化率低于 100/μg pET15b。但是，该操作大大节省了时间，不需要转化前的再培养，没有感受态制备或超低温冻存和转化后的温育等过程。同时单菌落的直接转化，由于菌量过少，通过钙转和电转难以实现。当然，本操作不适用于对转化率要求非常高的实验，但可以在条件非常落后的实验室中普及。该操作也可用于某些特殊的实验，比如某些致病菌对抗性质粒的易感染性等。

2.4 短乳酸杆菌AS1.579小片段RNA的提取

为了得到理想化的RNA小片段，采取基因组提取方法得到降解的RNA片段。经过该试验，可以从短乳酸杆菌得到理想的小片段RNA：浓度较高，大于200 ng/μL；分子量在300 bp左右 (图3)，根据文献报道，非常适合用于海泡石上 DNA竞争结合试验。同时，我们也尝试了其他微生物的RNA提取，但是得到的RNA总是一条模糊的带，分子量集中在500 bp和2 kb之间，不符合本试验的需要。对这种结果的差异，无法从试验过程中得知。

图3 1%琼脂糖凝胶电泳检测短乳酸杆菌AS1.579小片段RNA的提取Fig. 3 Analysis of 1% agarose for small RNA extraction from Lactobacillus brevis AS1.579. M: marker; 1: small RNA.

2.5 小片段RNA对pET15b转化E. coli DH5α的影响

经小片段RNA饱和的海泡石转化E. coli DH5α，与对照组相比，几乎没有什么变化 (图2，18~19)。同样说明，利用海泡石实现质粒转化，有可能不是海泡石带 DNA进入宿主内，而是由海泡石在宿主表面产生的瞬间小孔，导致外源DNA的随机进入。

3 讨论

利用海泡石转化有以下优点：可以实现质粒对细胞的转化；这种介质对人体健康友好，无致癌物质；本身无生物活性，不会对宿主生长产生影响；操作过程中不需特殊的设备；不需要感受态的制备就可以得到较高的转化率；另外，资源丰富、价格便宜，使这种转化方法容易推广。

但是，关于基于矿石海泡石纳米材料的 DNA转化机制仍然不很清楚。Yoshida等利用温石棉进行DNA试验，提出竞争机制，即海泡石温石棉大量吸附DNA，借助涂平板的机械摩擦力，纤维丝插入宿主内。宿主内的RNA与海泡石温石棉上的DNA竞争，从而实现外源基因对原核生物的转化[6,11]。Wilharm等对此方法进行了改进，采用无生物活性，对人环境友好的海泡石进行了DNA转化。但他们提出的转化机制仍然与 Yoshida等报道的相同。而我们试验表明海泡石吸附DNA的能力不是很强，洗涤后，转化率大大降低。而用RNA饱和后的海泡石，转化率几乎没有降低，这些结果说明，海泡石的作用是借助一种瞬间机械力，在细胞膜上击出孔，借此外源 DNA随即进入细胞。这种开孔现象是可逆的，移开海泡石，细胞膜会自动修复，将开孔重新封闭。细胞的这一特性，可使一些细胞外源DNA转入细胞内，从而达到复制或表达的目的。另外，由于对DNA转化机制理解的不同，导致操作方法有差异。Wilharm等根据他们提出的机制认为，在涂平板前要经过预干处理[6]。根据我们对该机制的理解，预干处理对提高DNA转化率不利。不经预干过程，用玻璃棒立即涂平板，转化率较高。而对照组，随着预干处理时间的延长，转化率会逐渐降低 (图2，样品13~15)。

在重新了解这种基于矿石纳米材料微生物转化机制基础上，我们对该转化进行了优化：使用对数生长初期的细胞为宿主，细胞浓度 OD600在 10~20之间，海泡石的浓度为0.1%，不经预干过程，不需要特定的缓冲液，持续涂平板时间在1 min以上，可以实现较高的转化率，有时高于钙转。这些不同于最近的报道[6]，但我们的转化方法变得更直接，转化时间变得更短。由于我们使用转化率较低的pET15b作为实验对象，说明这种方法可以用于多种质粒的转化。使用其他质粒如pUC18等可以得到大于1×106/μg质粒的转化率。这种转化方法适用于双链环状DNA (质粒)，线型DNA和其他微生物的转化有待摸索。

当然这种转化方法与电转的转化率还有很大差距，不同的人操作，会有较大的差异。但该方法无需感受态的制备、不需要贵重的仪器、甚至单菌落冷藏 1个月都可以直接实现转化，所以这种方法的简便性会得到很多研究者的青睐。海泡石用于微生物的DNA转化属于一种非常新的转化方法，而且提升的空间很高。在我们的试验中发现将DNA与E. coli DH5α在微型离心管内混合，枪头的随机抽动就可以实现DNA的转化，该现象预示可以通过海泡石、DNA和微生物的共培养就可以实现DNA的转化，这为研究特种微生物的DNA转化提供很新的方法。另外，海泡石可以用于革兰氏阳性菌的转化[1]。但该方法用于真核生物的DNA转化还没有报道，根据现有的转化机制推理，这种方法应该很快被用于真核生物的转化。

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