耐辐射奇球菌类胡萝卜素C3',4'-脱氢酶底物特异性

孙宗涛，田兵，沈绍传，华跃进

1 浙江大学原子核农业科学研究所，杭州 310029

2 浙江省农业科学院病毒学与生物技术所，杭州 310021

细胞工厂的优化

耐辐射奇球菌类胡萝卜素C3',4'-脱氢酶底物特异性

孙宗涛1,2，田兵1，沈绍传1，华跃进1

1 浙江大学原子核农业科学研究所，杭州 310029

2 浙江省农业科学院病毒学与生物技术所，杭州 310021

为了鉴定耐辐射奇球菌类胡萝卜素C3',4'-脱氢酶 (DR2250) 催化底物的特异性，利用PCR方法将dr2250基因的克隆到载体 pUC19上，形成了重组载体 pUC-CRTD。利用质粒共转化方法将不同组合的质粒 pACCRT-EBIEu、pRK-CRTC和pUC-CRTD转化到大肠杆菌中，筛选阳性克隆并提取其色素进行产物分析。结果表明，DR2250修饰的底物具有选择性，它不能以未经过羟基化修饰的直链类胡萝卜素为底物，而能在C1(1') 羟基修饰的羟基化类胡萝卜素的基础上进行C3',4'-脱氢反应。

耐辐射奇球菌，类胡萝卜素，C3',4'-脱氢酶, 底物特异性

Abstract:To examine the substrate specificity of carotenoid 3',4'-desaturase (DR2250) fromDeinococcusradiodurans, we amplified thedr2250gene by using PCR methods. The PCR products were digested byHind III-BamH I and ligated into the vector pUC19, yielding recombinant vector pUC-CRTD. We analyzed the carotenoids ofE.colitransformants containing pACCRT-EBIEuand (or) pRK-CRTC and (or) pUC-CRTD. Our results demonstrated that DR2250 had substrate specificity on the carotenoids with hydroxyl group at C1 (1').

Keywords:Deinococcusradiodurans, carotenoid, C3',4'-desaturase, substrate specificity

耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans(DR)是一种红色的、非流动性、不产生孢子的球形细菌。该细菌以对电离辐射、UV辐射、干燥等各种DNA损伤试剂具有超强的抗性而著称，它能在几个小时内准确地修复由辐射产生的几十个双链 DNA碎片[1]。研究报道称，电离辐射产生约80%的DNA损伤由辐射水解产生的活性氧自由基 (Reactive oxygen species，ROS) 攻击DNA造成的[2]，负责清除自由基的抗氧化系统对DR菌的抗性有着重要的贡献。

类胡萝卜素 Deinoxanthin作为DR菌非酶类抗氧化系统中的一种特殊天然化合物，能有效地清除过氧化氢 (H2O2)，猝灭单线态氧 (1O2) 等活性氧自由基，我们实验室的研究证明这种特殊结构的类胡萝卜素比其他类胡萝卜素有更高的自由基清除能力[3]。这种高效的自由基清除能力主要归功于deinoxanthin中存在着的多种活性基团如 C3',4'-双键、C1'-羟基、C4-酮基[4]。我们通过分子生物学方法对参与 deinoxanthin生物合成途径的合成酶进行了系统的研究，鉴定了八氢番茄红素合成酶 (CrtB，DR0862)[3]、八氢番茄红素脱氢酶 (CrtI，DR0861)[5]、C3',4'-脱氢酶 (CrtD，DR2250)[6]、C1',2'-水合酶(CruF，DR0091)[7]和 C4-酮基化酶 (CrtO，DR0093)[8]。通过对上述这些合成酶的突变体分析以及色素产物抗氧化能力实验，我们得知这些活性基团对 DR菌的辐射抗性有着重要的贡献。这些活性基团合成酶中，C3',4'-脱氢酶 (CrtD) 负责催化在类胡萝卜素的 C-3(3')，4(4')上脱氢形成不饱和键。在DR菌中，我们通过构建DR2250突变体研究得知其编码 C3',4'-脱氢酶，然而 DR2250所编码蛋白的催化功能的底物特异性却还不清楚，以下将围绕着DR2250的底物选择性展开研究。

1 材料与方法

1.1 菌种、质粒、试剂和主要仪器

大肠杆菌Escherichia coliDH5α和耐辐射奇球菌D. radioduransR1为本实验室保存。质粒pACCRT-EBIEu(德国Goethe大学Sandmann教授提供)、pRK-CRTC为实验室保存。质粒 pUC19、pMD18均购自TaKaRa公司。氨苄青霉素、氯霉素、四环素购自上海生物工程公司，引物合成由上海生物工程公司完成，HPLC级乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂购自美国 Tedia公司，PCR纯化和胶回收试剂盒购自 TaKaRa公司，基因组提取试剂盒和质粒抽提试剂盒购自百泰克公司，DNA测序反应均委托上海英骏公司完成。实验仪器包括：Waters 2695 Alliance高效液相色谱仪 (HPLC)、PCR扩增仪、凝胶成像系统Model-3000 (美国Bio-Rad公司) 等。

1.2 基因克隆与重组载体构建

耐辐射奇球菌在 30℃用 TGY液体培养基(5 g/L胰蛋白胨，3 g/L酵母提取物，1 g/L葡萄糖) 培养过夜，利用基因组提取试剂盒进行基因组的提取。设计引物：P1：5′-CgGTaagctt GATGATACTGCTCCC GCTACACTGC-3′ (下划线部分为Hind III 位点)，P2：5′-CAGCggatcc CGGTCCGCCATAAGAATCAA G-3′ (下划线部分为BamH I位点)，以野生型R1基因组作为模板，进行PCR扩增，获得 PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化，纯化片段再经HindIII和BamH I双酶切后电泳割胶回收；回收纯化片段并连接到同样双酶切的pUC19质粒，将连接产物转化大肠杆菌并最终获得重组质粒pUC-CRTD。重组表达质粒经过测序验证，确定没有任何碱基发生突变和移码。

1.3 不同重组转化体的获得

不同组合的质粒 pACCRT-EBIEu、pRK-CRTC和pUC-CRTD利用常规CaCl2转化方法分别转化大肠杆菌，在 LB抗性平板进行筛选，挑取阳性克隆并进行质粒酶切鉴定。

1.4 菌体合成色素产物的鉴定

将上述获得的重组大肠杆菌菌株转入 100 mL LB培养基培养，37℃培养至OD600≈0.5，加IPTG(0.5 mmol/L) 诱导，250 r/min继续培养 24 h，6 000 r/min离心10 min收集细胞，使用缓冲液清洗2次后，使用丙酮/甲醇溶液 (7∶2，V/V) 提取菌体色素。

通过HPLC方法对大肠杆菌合成的色素进行分析，色谱分析条件如下：Waters Alliance 2695高效液相色谱系统，Hypersil ODS-C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 µm)，Waters-Millennium 32 色谱工作站，Waters 996光电二极管检测仪检测波长200～800 nm，流动相使用乙腈-甲醇-异丙醇 (40∶50∶10，V/V/V)，流速1 mL/min，柱温35℃，进样体积20 µL。

2 结果

2.1crtD基因的克隆与载体pUC-CRTD的构建

以耐辐射奇球菌R1菌株基因组为模板，通过体外PCR扩增的方法获得DR2250全基因产物，电泳结果显示PCR产物与理论值相同，大小为1 476 bp(图 1)。经过HindIII和BamH I双酶切后的 PCR产物和同样双酶切过的载体pUC19在T4 DNA连接酶的作用下形成重组载体 pUC-CRTD。经过酶切电泳验证 (图 1) 和测序，重组载体 pUC-CRTD构建正确。

图1crtD基因和重组载体pUC-CRTD的酶切电泳鉴定图Fig.1 PCR product of thecrtDgene and confirmation of recombinant plasmid pUC-CRTD. 1: PCR product of thecrtDgene; 2: pUC19 vector digested byHindIII andBamH I; 3:the recombinant vector pUC-CRTD digested byHindIII andBamH I; 4: marker.

2.2 CrtD蛋白功能分析

为了验证 DR2250蛋白的功能和底物特异性，我们利用质粒共转化的方法来检验其功能。质粒pACCRT-EBIEu在大肠杆菌中能产生番茄红素，而质粒pRK-CRTC则能在番茄红素的基础上通过水合反应产生羟基化的番茄红素[9]。首先构建了能表达DR2250的克隆载体 pUC-CRTD，然后利用常规CaCl2转化方法分别转化上述不同组合的质粒混合物，得到的克隆经过鉴定后，提取类胡萝卜素进行液相色谱分析。

HPLC分析结果如图 2所示，只含有质粒pACCRT-EBIEu的大肠杆菌中产生番茄红素 (图2，峰6)。当共转化质粒pACCRT-EBIEu和 pUC-CRTD时大肠杆菌也只产生一种类胡萝卜素 (峰 6)，其保留时间和吸收光谱与番茄红素相同 (图 3)，这表明当 DR2250表达在产生番茄红素的大肠杆菌中不能使其发生脱氢反应，因此，DR2250并不能以番茄红素为底物。当共转化质粒 pACCRT-EBIEu和pRK-CRTC到大肠杆菌后产生3种类胡萝卜素，根据它们的保留时间、吸收光谱 (图3) 以及对照以前的文献[10-11]，这3个产物分别为1,1'-二羟基-番茄红素 (图 2，峰 3)、1-羟基-番茄红素 (图2，峰 5) 和番茄红素 (图2，峰6)。当共转化质粒pACCRT-EBIEu、pRK-CRTC和pUC-CRTD时，类胡萝卜素组成发生了明显的变化 (图2)，产生了3个新的产物峰1、峰 2、峰 4。峰 4 (λmax=456，483，517 nm) 与峰 5(λmax=445，471，502 nm) 相比发生了红移约10 nm(图 3)。

图2 DR2250蛋白功能分析Fig.2 HPLC analysis of carotenoids in lycopene-producingE.colitransformants containing the plasmids pACCRT-EBIEu;pACCRT-EBIEuand pUC-CRTD; pACCRT-EBIEuand pRK-CRTC; pACCRT-EBIEu, pRK-CRTC and pUC-CRTD.Peak 1: 1,1’-(OH)2-3,3',4,4'-tetradehydrolycopene; peak 2:1,1’-(OH)2-3,4,-didehydrolycopene; peak 3: 1,1’-(OH)2-lycopene;peak 4: 1-OH-3,4,-didehydrolycopene; peak 5: 1-OH-lycopene;peak 6: lycopene.

图3 峰1～6的紫外可见吸收光谱图Fig.3 UV-vis spectrum for peak 1−6 inE. colitransformants.

类胡萝卜素碳骨架上规律性排列的共轭双键系统使得类胡萝卜素在可见光区以及在紫外区具有特征吸收峰，而类胡萝卜素的吸收光谱与共轭双键的数目有关，并呈现一定的规律性[9]：类胡萝卜素的最大吸收光值 (λmax) 与共轭双键数目有关，λmax随着共轭双键数目的增加而增大。按照此理论，每增加一个共轭双键，λmax值就会向长波方向移动10 nm[12]。羟基、甲氧基、含氧的非共轭基团不会影响λmax值。对于无环化的类胡萝卜素如番茄红素，它的共轭系统是以接近平面的构型存在的，所以它的吸收光谱图是尖的精细的三指状吸收峰。因此，UV-Vis λmax值、光谱的形状都可以作为鉴定类胡萝卜素化学结构 (尤其是共轭双键结构) 的一种重要依据。这意味着峰4比峰5多一个共轭双键。我们以前的实验结果表明DR2250编码类胡萝卜素C3,4-脱氢酶[6]，因此，可以判断峰4产物是在峰5产物的C-3,4位置上脱氢得到的，其结构为1-羟基-3,4-双脱氢-番茄红素。同样的比较峰2与峰3的吸收光谱，峰2 (λmax=456，483，517 nm) 比峰 3 (λmax= 445，471，502 nm)发生了红移约 10 nm，同样意味着峰 2产物比峰 3产物多一个共轭双键数目，峰2产物是在峰3产物的C-3,4位置脱氢得到的，其结构为1,1'-二羟基-3,4-双脱氢-番茄红素。观察峰 1的吸收光谱图，它(λmax= 466，495，528 nm) 比峰2和峰3分别大了10多纳米和20多纳米，意味着峰1产物有着比峰2产物更多的共轭双键数目，它是在峰2产物的C-3,4位置上再进一步脱氢产生的，其结构为1,1'-二羟基-3,3',4,4'-四脱氢-番茄红素。

根据以上实验结果，我们可以看出，DR2250不能直接以未经过羟基化修饰的番茄红素为底物，而能在 C1 (1') 羟基修饰的羟基化类胡萝卜素基础上催化发生脱氢反应。

3 讨论

Deinoxanthin作为耐辐射奇球菌中主要的类胡萝卜素，其高效的清除自由基的能力已经得到验证，但其体内的合成途径却没有完全阐明。我们以前的研究结果表明DR2250蛋白参与了deinoxanthin的生物合成，负责催化 C3',4'-脱氢反应，但其催化的底物特异性却没有足够实验证实。本文利用质粒共转化实验揭示了CrtD的催化底物是具有选择性的，它不能识别 C1(1')位没有羟基修饰的类胡萝卜素，而能在C1(1')位存在羟基基团的基础上进行脱氢反应。由此也可以验证 DR2250所催化的脱氢反应在耐辐射奇球菌deinoxanthin生物合成途径中是在C1位羟基化以后发生的。对 DR2250蛋白底物特异性的研究有助于我们深入了解 deinoxanthin生物合成途径中的反应步骤，同时这一特性将对构建工程菌株合成具有高效自由基清除能力的类胡萝卜素具有重要意义。

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Substrate specificity of carotenoid 3',4'-desaturase fromDeinococcus radiodurans

Zongtao Sun1,2, Bing Tian1, Shaochuan Shen1, and Yuejin Hua1

1Institute of Nuclear-Agricultural Sciences,Zhejiang University,Hangzhou310029,China
2Department of Virology and Biotechnology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou310021,China

Received:June 2, 2010;Accepted:September 10, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707804), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021305), National Natural Science Foundation of China (Nos. 30830006, 30670026, 30870035), Project‘Application of Nuclear Techniques in Agriculture’ from the Chinese Ministry of Agriculture (No. 200803034).

Corresponding author:Yuejin Hua. Tel/Fax: +86-571-86971703; E-mail: yjhua@zju.edu.cn

国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2007CB707804)，国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2007AA021305)，国家自然科学基金项目 (Nos. 30830006, 30670026, 30870035)，农业部核技术农业应用项目 (No. 200803034) 资助。