IFN-γ促进孕期胚胎神经干细胞MHC表达的影响

石 蕊,王玉贤,杨海澜

近些年来,有多种的研究表明,神经干细胞在胚胎[1]和成年哺乳动物中枢神经系统的不同部位比如脊髓、海马、纹状体[2]等都有存在,它是一群具有自我更新和多向分化潜能的细胞,它的发现为人们深入研究中枢神经系统的发育、分化以及探索治疗神经系统疾病的新途径开辟了新的思路。出生后胎儿功能健全的神经系统对于胎儿、家庭和社会都具有极其重要的意义。但是胎儿在母体期间,会受到多种环境因素的影响,例如药物[3]、病毒[4]、细菌、宫腔感染释放的各种感染因子[5]等等,这些因素对胎儿身体,尤其是大脑发育可能会造成不可逆的影响。本研究在胚胎神经干细胞体外培养模型的基础上,检测γ干扰素(IFN-γ)这一常用炎症因子对胚胎神经干细胞的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用孕14 d～16 d Wistar大鼠由上海交通大学医学院实验动物中心提供。所有的实验操作均按照美国国家研究委员会1996年制定的“实验动物使用和保护指南”和上海交通大学医学院动物保护和使用委员会制定的“鼠类生存手术指导方针和政策”执行。

1.2 实验方法

1.2.1 神经干细胞的分离和培养 取孕16 d胚龄的SD大鼠,经乙醚麻醉,常规消毒后取其胚胎,于显微手术镜(Lecia)下剥离大脑半球及脊髓组织,分别置于L15培养液(GIBcoBRL公司)中,吹打成细胞悬液。收集细胞悬液过尼龙筛网后,离心并重悬于无血清的神经干细胞基础培养液DFNG(DMEM/F12培养液、N2、谷氨酰胺,GIBcoBRL公司)中,按1×105/mL密度种瓶,同时添加碱性成纤维生长因子(bFGF,GIBcoBRL公司)和表皮生长因子(EGF,Sigma公司,终浓度均为20 μ g/L),于 5%CO2,37℃细胞培养箱中培养。

1.2.2 神经干细胞的分化 神经干细胞分化实验时,将分散的单个细胞种于多聚赖氨酸包被的培养盖玻片上,接种密度为每片种5万个活细胞。分化培养液为DFNGH添加1%FBS,(fetal bovine serum,GibcoBRL公司),每3 d换液一次。于接种后第6天用于免疫组化染色。IFN-γ处理组的细胞加入IFN-γ(200 U/mL)至分化培养液中孵育。

1.2.3 免疫组化 取切片回复至室温,10mmol/LPBS(pH 7.4)水化10 min。神经干细胞鉴定时,切片用含0.3%Triton X-100的1×PBS预渗透15min,然后用含10%正常山羊血清或正常驴血清的0.3%Triton X-100-PBS/PBS室温封闭1 h。加适当稀释度的一抗4℃孵育过夜。一抗包括:小鼠抗大鼠Nestin单抗(IgG1,BD Pharmingen公司),用于鉴定神经干细胞;兔抗βⅢ-tubulin多抗(Covance Research Products公司),用于鉴定神经元;兔抗GFAP多抗(Sigma公司),用于鉴定星型胶质细胞;小鼠抗 RIP单抗(IgG3,Chemicon公司),用于鉴定少突胶质细胞。切片最后用 PBS洗 3次(每次10 min),然后用含有Hoechst33342(Sigma公司,用于染核)的Gel/Mount aqueous(Biomeda公司)封片后,置 Olympus BX60荧光显微镜下镜检。

1.2.4 流式细胞术 将经吹打分散的单个细胞重悬于冰浴的PFN(PBS/2%FCS/0.1%Nazide)溶液中,与FITC标记的抗MHC-I类分子抗体(OX-18)或抗MHC-Ⅱ类分子抗体(OX-6,Serotec公司)于4℃孵育30 min。然后细胞用冷的PFN洗两次,冰丙酮固定10 min后重悬于PFN中立即上FACS Calibur(BD Biosciences,Mountain View,CA)分析。每个样本分析1万个细胞。通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)设门,去除细胞碎片。

2 结 果

2.1 神经干细胞的鉴定 取孕16 d胚龄的Wistar大鼠,分离其前脑胚胎神经干细胞,在无血清的神经干细胞基础培养液DFNG中,按1×105/mL密度种瓶,同时添加碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF),促使其增殖,经过 3 d～4 d能够形成较大的神经球,此时可以进行冻存或者传代。对神经球切片,进行免疫荧光分析表明,90%以上的神经干细胞都是Nestin阳性的细胞。神经干细胞分化实验时,将分散的单个细胞种于多聚赖氨酸包被的培养盖玻片上,接种密度为每片种5万个活细胞。分化培养液为DFNGH添加1%FBS,撤去bFGF和 EGF并且添加FBS,是为了促进分化,每3 d换液1次,于接种后第6天用于免疫组化染色。染色结果表明,体外培养的胚胎神经干细胞能够分化成β-tubulinⅢ阳性的神经元、Rip阳性的少突胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞。

2.2 IFN-γ影响神经干细胞的生长状态 采用20 U/mL、200 U/mL和2 000 U/mL IFN-γ对神经干细胞进行刺激。在传代后1 d加入不同浓度的IFN-γ,刺激1 d后,神经干细胞呈现出不同的生长状态。可以明显地看出,随着浓度的增高,神经干细胞逐渐丧失了成球生长的特性,而逐渐贴壁,伸出大量突起;胚胎神经干细胞:从形态上可以发现,没有加入IFN-γ的神经干细胞保持了强大的增殖能力,但随着IFN-γ浓度的增加,神经干细胞的增殖能力逐渐减弱,而成球生长的能力丧失,倾向于贴壁生长,伸出较多突起。4倍镜下。经过3d的培养,发现,2 000 U/mL IFN-γ的浓度对神经干细胞生长有明显的毒性作用。培养瓶中细胞大量死亡,而其他浓度细胞未见明显死亡。接着,取 4种 IFN-γ刺激浓度(0、20 U/mL、200 U/mL、2 000 U/mL)的细胞上清进行LDH毒性测试,也证实了这个结论。

2.3 IFN-γ促进神经干细胞MHC分子的表达 采用流式细胞术,针对大鼠M HCⅠ类和Ⅱ类分子的相应抗体OX-18和OX-6,对刺激2 d的神经干细胞进行检测。结果发现,体外培养的神经干细胞既表达MHCⅠ类分子,也表达M HCⅡ类分子,但表达量很低。但是,经过炎性因子IFN-γ刺激以后,神经干细胞MHCⅠ类和Ⅱ类分子的表达显著上调。

3 讨 论

在孕期胎儿神经系统的发育是胎儿发育中重要的一环,在这个过程中胎儿生长环境的任何变化,都可能导致胎儿发育的异常。神经干细胞是神经发育的起始细胞,由干细胞发育而来,具有自我复制和多向分化的潜能,能够分化成神经元,少突胶质细胞和星形胶质细胞,是神经发育的重要细胞。IFN-γ是一种重要的炎性介质,在病毒感染,细菌感染等疾病中大量分泌,但是IFN-γ是否会影响神经干细胞的生长状态,对神经干细胞有怎样的影响呢?

在本研究中,建立了大鼠神经干细胞体外培养模型,在此基础上发现,IFN-γ在高浓度情况下,对神经干细胞具有显著的毒性作用,在中等剂量下,会促进孕期胚胎神经干细胞的MHC的表达。由于MHC作为主要组织相容性抗原,在器官排斥中起重要作用,它的表达上调,推测IFN-γ可能在胎儿发育过程中起到非常重要的作用。大剂量IFN-γ对神经干细胞具有毒性作用,其毒性具有剂量依赖作用,提示严重的感染或者疾病,产生的炎性因子可能直接对胎儿产生不利影响。

关于神经干细胞是否表达MHC分子,近些年才有一些报道,但是由于采用的种属和细胞培养方法不同,结果也有一些不同。McLaren[6]报道大鼠的神经干细胞低水平,表达了MHCⅠ类分子但不表达M HCⅡ类分子,而Sun等[7]发现,IFN-γ能够在早期妊娠增加非经典的MHCⅡ类抗原RT1-DM和经典的MHC I类抗原RT1-A的表达,而在妊娠中期降低它们的表达。在晚期妊娠,胎盘RT1-A的表达降低,在子宫中升高,而RT1-DM在子宫和胎盘中都升高。本研究结果显示,正常细胞培养情况下,大鼠的神经干细胞低水平的表达MHC抗原,但是IFN-γ能够显著上调其表达。MHC作为一种主要的移植抗原,表达的上调意味着胎儿被排斥风险的增加,以及神经系统发育障碍的机会增大。从另外一方面讲,MHC是否参与神经系统发育过程,也是值得关注的一个问题。

[1]Smith AG.Embryo-derived stem cells:Of mice and men[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2001,17:435-462.

[2]Conti L,Reitano E,Cattaneo E.Neural stem cell systems:Diversities and properties after transplantation in animal models of diseases[J].Brain Pathol,2006,16:143-154.

[3]Tatum WO.Balancing the risks to the fetus from epileptic seizures and antiepileptic drug exposure in pregnancy[J].Expert Rev Neurother,2009,9:1707-1708.

[4]黄星,蒋艳敏,秦雪,等.乙肝病毒宫内感染与脐血 Th1/Th2细胞亚群体外活化的研究[J].中国妇幼保健,2007,22(10):1398-1399.

[5]毛会军,胡雪梅,张群,等.早孕期弓形虫感染对大鼠胎盘IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平的影响[J].现代免疫学,2007,27(5):386-391.

[6]McLaren FH,Svendsen CN.Analysis of neural stem cells by flow cytometry cellular differen-tiation modifies patterns of M HC expression[J].J Neuroimmunol,2001,112(1-2):35-46.

[7]Sun Q H,Peng JP,Xia HF,et al.Effect on ex pression of RT1-A and RT 1-DM molecules of treatme-nt with interferon-gamma at the maternal-fetal interface of pregnant rats[J].Hum Reprod,2005,20(9):2639-2647.