组织工程骨修复骨不连研究进展

赵福江，王云亭

（中日友好医院 骨科，北京 100029）

组织工程骨修复骨不连研究进展

赵福江，王云亭⋆

（中日友好医院 骨科，北京 100029）

骨不连是骨折常见并发症。美国每年发生的约600万骨折患者中，约5%～10%发生骨不连[1]。骨不连的治疗措施多种多样，自体骨移植是目前临床上治疗骨不连的主要方法。但该方法存在一些缺陷，并可带来一些并发症，不利于其在临床上的广泛使用[2]。用组织工程骨替代自体骨移植来促进骨生成是近年来研究的热点。现就组织工程骨修复骨不连的研究进展情况做一综述如下。

1 骨不连

1.1 骨不连概述

骨不连是指骨折后未形成骨连接，骨愈合过程停止。对于诊断骨不连的确切时间没有明确的定义，美国食品与药品管理局（FDA）将其定义为9个月[3]。根据X线表现，骨不连可以分为萎缩型和肥大型骨不连两种类型。肥大型骨不连骨折端有充分的血供[4]，萎缩型骨不连主要是由于骨折端血运缺乏所致，成骨能力下降[5]。

1.2 骨不连的病因

引起骨不连的原因很多，主要包括全身因素和局部因素。全身因素包括营养不良，糖尿病，吸烟，骨质疏松以及非甾体类抗炎药的使用；局部因素包括局部感染，血运缺乏，骨折端固定不牢固，骨折端接触不充分以及高能量损伤等[6]。影响骨折愈合的根本因素在于骨折局部的血液供应。Reed等[7，8]研究发现萎缩型骨不连患者和肥大型骨不连患者骨折处的血管计数基本相同，并通过动物试验发现萎缩型骨不连骨折处血运在早期明显减少，3周时开始增多，到第8周时和肥大型骨不连处血管计数基本相同。因此，Reed认为血运不足是引起骨不连的主要原因。后期虽然血运恢复，但骨愈合过程已停止，骨不连继续存在[7]。

1.3 骨不连目前的治疗方法及存在的缺陷

骨不连目前主要的治疗主要包括牢固的固定和自体骨移植。自体骨移植包括了骨修复所有的核心因素：（1）骨引导作用的三维支架；（2）骨诱导作用的生长因子；（3）成骨作用的细胞[9]。自体骨移植治疗骨不连治愈率较高，但是在取得良好效果的同时也伴随着一些不利因素，限制了骨移植治疗的广泛使用[2]。自体骨移植来源有限，尤其是在伴有较大的骨缺损或者缺损形态不规则的时候，自体骨移植很难提供充足及合适的骨。而且自体骨移植还可能带来很多并发症：自体骨移植需行手术从患者体内取骨，对患者造较大的创伤；还可能造成伤口感染，术后供骨区持续疼痛及伤口处血肿等，给患者带来很大痛苦。这些不利因素都不利于自体骨移植的广泛使用。同种异体骨来源也有限，且有传播肝炎和艾滋病等传染病的危险，而且牵涉伦理问题。异种骨移植虽然来源广泛，但免疫排斥反应严重，成骨能力较差[10]。为了克服骨移植在治疗骨不连中的缺陷，很多专家学者开始寻找骨移植的替代治疗。

2 骨组织工程在治疗骨不连中的作用

2.1 骨组织工程概述

骨组织工程是将患者或供者的特定细胞（干细胞、祖细胞）在体外支架材料上生长，形成一个三维结构，然后移植到患者体内[11]。移植后，细胞分化并转移到支架内部，血管附上并蔓延到新组织内部，然后生成骨组织。骨组织工程的最终目的是将支架材料在体内诱导成骨样结构，从而取代缺损或病变的骨组织[11]。

2.2 血管化在骨组织工程中的作用

骨折愈合是一个复杂的过程，要求各种细胞的活化、迁移、分化成熟，合成细胞外基质和各种形态结构[12]。因此血管生成过程是早期创伤和骨折愈合过程中的关键因素，并且是充足的氧气和营养物质供应，以及引导炎性细胞到达创伤部位最重要的因素[4]。移植后生物材料成功引导骨生成依赖于能发挥生物活性的细胞[13]。该过程中，骨细胞长入支架内部及生物材料内部血管生成必须同时发生。血管的生长范围决定新生骨生成情况。骨的生长需要血管网络提供营养物质，带走代谢产物。但矿化骨不能通过渗透和扩散作用提供营养，血管只能在100μm以内提供营养，100μm外的各种细胞因得不到充足营养不能存活[14]。因此，在组织工程骨治疗骨不连过程中，提高组织工程骨的血管化水平成为移植成功的关键。

2.3 种子细胞

随着干细胞与组织工程技术的进步，对骨组织工程的认识更加深入。许多文献报道成功的骨移植材料需要提供骨折愈合的三个核心要素：骨引导作用的支架材料，骨诱导作用的生长因子以及成骨细胞[13]。而骨引导与骨诱导作用的发挥依赖于成骨细胞的作用[9]。对种子细胞的研究也从单纯间充质细胞过渡到成骨细胞和血管内皮细胞。

2.3.1 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞，是由中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能，不仅能分化为造血实质支持造血，还可以分化为多种造血以外的组织细胞，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、肝细胞、脂肪细胞等[16]。目前已有研究表明MSCs可以分化为成骨细胞，并已通过特定的条件在体外成功诱导分化出成骨细胞[17]。骨折的愈合主要包括膜内成骨和软骨内成骨两个过程。膜内成骨是MSCs增殖分化为成骨细胞，由成骨细胞生成骨组织；软骨内成骨是MSCs分化为软骨细胞，形成软骨，再通过一系列重塑过程形成骨组织。因此，MSCs是具有成骨潜力的细胞，骨愈合过程离不开MSCs的参与[12]。在当前的骨组织学研究中，大量学者使用MSCs做为种子细胞与支架材料结合研究骨生成情况。有学者将载有MSCs的三维支架移植到经免疫抑制的小鼠皮下，发现有新骨组织生成[18]。

将MSCs作为种子细胞的组织工程骨用于治疗骨不连，无法解决三维支架内部血运缺乏的问题。由于三维支架内血管缺乏，将负载MSCs的三维支架材料移植到动物体内后，大量MSCs因无法获得足够的氧气与营养物质而坏死[19]，数量减少。此外，MSCs需转化为成骨细胞才能发挥成骨作用，而人体内MSCs数量有限，且只有很小一部分能转化为成骨系细胞发挥成骨作用[20]。鉴于以上不足，一些学者开始考虑使用具有直接成骨作用的成骨细胞及有成血管作用的内皮细胞联合来治疗骨不连[19，21]。

2.3.2 成骨细胞

在骨折愈合及骨骼发育过程中，新骨的生成是一个复杂、多阶段的过程，包括一系列的生物反应。在第一阶段，成骨细胞或其祖细胞从周围的组织及血液循环中募集到将要发生骨生成的部位[22]。到达特定部位后，细胞增殖分化为成熟的功能成骨细胞，产生细胞外基质，形成骨。因此，成骨细胞或其祖细胞聚集到骨折部位是新骨生成的基础[23]。骨不连，尤其是萎缩型骨不连患者，由于缺乏血供，成骨细胞及其祖细胞无法正常到达骨折部位，使正常骨折愈合过程无法继续进行。如果将成骨细胞作为组织工程的种子细胞，移植到骨不连处，成骨细胞即可在原位分泌细胞外基质，促进骨不连愈合。使用成骨细胞避免了从MSCs分化为成骨细胞的过程，从而缩短了骨愈合的时间，并可保证成骨细胞的数量。当前体外诱导分化成骨细胞的技术已经比较成熟，已有很多学者将骨髓间充质细胞经体外诱导分化为成骨细胞[17]。

2.3.3 内皮细胞

骨组织成功移植需要许多复杂的过程。首先发生急性炎症反应，随后的修复过程导致骨折愈合。在这个过程中，骨细胞和血管必须同时长入支架材料。内皮细胞是这些过程中主要的细胞。它参加炎性反应过程，并通过分泌炎性因子和表达细胞粘附分子参与骨修复过程[24]。除此之外，内皮细胞还构成了血管的内壁[21]。内皮细胞在血管生成刺激物，比如1型胶原、VEGF、和bFGF的作用下，在体外可以生成管腔样结构[24]。内皮细胞可以从人脐静脉中得到，并通过体外培养得到扩充。但通过这种途径获得内皮细胞来源有限。现在，人们发现MSCs具有分化成内皮细胞的潜能。MSCs来源广泛，已有学者通过在体外利用血管内皮细胞生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、纤维素样生长因子-B（fibroblast growth factor-B，b-FGF）成功将MSCs诱导成内皮细胞[25]。

2.3.4 内皮细胞与成骨细胞联合作为种子细胞

由于上述内皮细胞的成血管作用和成骨细胞的成骨作用，将两者联合作为种子细胞有望成为治疗骨不连一种新的方法[14]。包含内皮细胞和成骨细胞的三维支架，在植入体内前经过一段时间的体外诱导，生成血管[21]。植入体内后，这些血管就可发挥功能，带来氧气及营养物质，使成骨细胞充分发挥成骨作用，从而有利于骨折愈合，克服了将成骨细胞单独作为种子细胞的缺陷。另外，这两种细胞除了各自的成骨和成血管作用以外，还具有相互促进的作用[26～29]。

研究表明，血管内皮细胞可以分泌一些细胞因子影响成骨细胞的功能和分化，而成骨细胞除表达这些细胞因子的受体外还可以分泌细胞因子影响内皮细胞的功能[26]。血管内皮细胞可以分泌骨形态蛋白 （bone morphogenic proteins，BMPs）及内皮素-1（endothelin-1，ET-1）等细胞生长因子[27]。BMP是作用最强的骨诱导蛋白：BMP能促进成骨细胞的趋化作用，BMP-2能诱导骨髓间充质祖细胞诱导分化为成骨细胞[28，29]。ET-1能够诱导成骨细胞增殖和分化，并能够促进成骨细胞碱性磷酸酶的表达和?型胶原的生成[25]。内皮细胞通过这两种作用提高成骨细胞的成骨能力。除此之外，成骨细胞可以分泌VEGF[30]。VEGF能够促进MSCs诱导分化为内皮细胞，并使内皮细胞生成血管[25]。Unger等[21]将内皮细胞与成骨细胞在体外联合培养，在不加任何生长因子的情况下见到管腔样结构和骨样组织生成。而将两者单独培养，则基本上没有管腔结构，且仅有少量骨组织生成。张建等[31]发现内皮细胞和成骨细胞联合作为种子细胞修复下颌骨缺损时，无论是促进骨生成还是促进血管生成的效果都要明显高于单纯成骨细胞。

3 组织工程骨治疗骨不连的现状及展望

目前，组织工程骨的研究以及在临床上的使用已经取得了一定的成果。Kruyt等[32]使用BMSCs做为种子细胞植入山羊的脊柱间发现了明显的成骨反应；Kitoh等[17]在施行3例骨延长手术时，将BMSCs配合富含血小板的血浆注入牵拉成骨的部位，发现可以明显提高成骨的速度；Yu等[14]将MSCs诱导为血管内皮细胞和成骨细胞，然后将两种细胞联合培养，得到血管化的组织工程骨，植入动物体内后，发现其成骨作用较单纯使用成骨细胞有明显提高。Gan等[15]利用患者自体骨髓细胞进行离心浓缩后，将得到的MSCs与β-三磷酸钙混合后用用于脊柱融合，取得了较好的效果。杨志明等[33]应用自体BMSCs对52例患者多个部位的骨缺损、骨不愈合进行修复，初步证实：①组织工程骨具有良好的成骨能力和修复效果；②采用同种异体来源的成骨细胞未发现明显组织排斥反应及其他并发症。

但是，目前组织工程骨的应用还存在一些问题：种子细胞往往需要体外培养或诱导达到一定的数量后，才能在体内发挥最大的作用，而体外环境无法完全模拟体内环境，因此，种子细胞的安全性问题需要我们更进一步的研究[34]。此外，进行不同类型组织工程骨构建研究，以及具有活力的血管化组织工程骨的构建，是组织工程临床应用所必须解决的关键技术问题[35]。

骨组织工程的临床应用尚处于起步阶段，距离广泛的临床应用还有很长的路要走。随着组织工程越来越受到广大学者的关注，相信不久的将来，组织工程在基础研究及临床使用上将会取得突破性的成果。

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R68

A

1001-0025（2010）01-0051-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2010.01.016

卫生部临床学科重点项目[2007]353号；国家自然科学基金（30772194，30672117）。

*本文通讯作者。

赵福江（1981-），男，住院医师，医学硕士。

2009-08-04

2009-12-29