正交设计优化制备马钱子微囊

闫雪生， 付加雷， 李 岩， 王 飞

(1.山东省中医药研究院，山东济南250014;2.山东大学药学院，山东济南250014)

临床上使用马钱子(Semen strychni)治疗癌症及癌症疼痛、神经性疾病、骨性疾病以及带状疱疹等［1－2］。马钱子虽然临床应用广泛，但由于它的治疗量与中毒量比较接近，限制了它的临床使用。

微型包囊技术(microencapsulation)是近30年来应用于药物的新工艺、新技术。其制备过程，系利用天然的或合成的高分子材料为囊材作为囊膜，将固体药物或液体药物做囊心物包裹而成药库型微小胶囊，称为微囊(microcapsule)［3］。中药缓释微囊可以延长药物释放时间，减少给药次数，控制药物的释放量，从而减轻药物毒副作用，特别适合于那些活性强、毒性大、治疗量与中毒量接近或用于慢性疾病治疗的中药。

本实验以马钱子为模型药，以乙基纤维素(EC)为囊材，采用液中干燥法制备马钱子微囊，并以药物包封率、载药量和微囊粒径为指标，设立总的评估指数，进行正交实验优化制备工艺。

1 材料

马钱子(山东天一中药饮片有限公司);乙基纤维素(山东聊城阿华制药有限公司20060301);丙酮(山东莱阳经济技术开发区精细化工厂20020918);Span－80(天津市广成化学试剂有限公司20050819);液体石蜡(天津市永大化学试剂开发中心出品20060621);石油醚(天津市广成化学试剂有限公司080515);马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所0705—9304);三氯甲烷(莱阳市康德化工有限公司，20071103);甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，080608)。

BP211D赛多利斯分析天平;贝利微粉机(济南倍力粉技术工程有限公司);D—971型铝城牌无级调速搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);BH光学显微镜(OLYMPUS，Japan);AH—2光学显微镜(OLYMPUS，Japan);pHB－4便携式酸度计(上海伟业仪器厂);RE52—99旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);高效液相色谱仪(Agilent 1200)。

2 方法

2.1 原料药、囊材准备以及油水比例和表面活性剂用量的初步确定

2.1.1 马钱子的微粉化 为了制备的马钱子微囊均匀，使用贝利微粉机将马钱子微粉化，振荡80 min。进行粒径分布测量，得粒径≤120 μm，结果见图1。

图1 马钱子微粉粒径分布图

2.1.2 油水比例(液体石蜡:丙酮)和表面活性剂用量的初步确定 取25 mL带塞试管，加10 mL液体石蜡、2.5 mL丙酮、1滴表面活性剂，充分振荡后，所得乳剂1 min内分层。再加1滴表面活性剂，仍分层明显。再加3 mL液体石蜡，分层情况好转。再加1滴表面活性剂，无明显变化。再加2 mL液体石蜡，几乎无分层现象，显乳白色。再加1滴表面活

性剂，乳白色均匀，无分层现象。再加1滴表面活性剂，乳白色更明亮。再加1.5 mL丙酮，再次分层。

2.1.3 EC的丙酮溶液的制备［4］将EC过80目筛，取10 g EC溶于200 mL丙酮中，搅拌，放置3～4 d。

2.2 马钱子微囊的制备工艺 将马钱子细粉加入到EC的丙酮溶液中，在冰水中搅拌30 min，所得混悬液，加入到含有表面活性剂司盘－80的液体石蜡中，并搅拌。将体系温度逐渐升至25℃，保温搅拌一定时间，1 h后过滤，所得固体物用石油醚洗涤3次，室温干燥，得粉末状微囊［4－6］。

2.3 因素和水平的确定 根据有关文献及预试验，选取EC与药物的比例、油/水相比例、表面活性剂的用量和反应温度4个因素，每个因素选取3个水平(见表1)，选用L9(34)表进行正交实验优化制备工艺［7－9］。

表1 正交实验因素及水平

2.4 评估指数(Y)的选取 综合微囊性质的各项考察指标的测定结果，来评定处方工艺。评估指数Y为微囊粒度分布(总共50分，按照微囊形态是否圆整、均匀及粒度分布范围大小评定)×0.10，载药量(若为40% 即为40分)×0.60与包封率(若为80% 即为80分)×0.30之和。公式如下:

评估指数Y=粒度得分×10%+载药量×60%+包封率×30% 。

2.5 评估指数(Y)的测定

2.5.1 供试品溶液的制备 取适量马钱子微囊，在研钵中充分研成细粉。取马钱子微囊粉适量(约相当与马钱子粉0.3 g)，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，加氢氧化钠试液1.5 mL，混匀，放置30 min。精密加甲醇20 mL，密塞，称定重量，置水浴中回流提取2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量。摇匀，将三氯甲烷提取液滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液3 mL，置50 mL锥形瓶中，水浴锅上蒸干，加入10 mL用于高效液相的流动相，超声30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。取10 μL进样测定。按照中国药典(2005版)相关方法，对马钱子原料中的马钱子碱进行含量测定［10］。

2.5.2 载药量和包封率的计算

载药量=测得微囊药物质量/微囊质量×100%

包封率=微囊质量×载药量(%)/投药量×100%

2.6 正交实验复核实验 按正交实验优化处方，制备3份马钱子微囊，测定包封率和载药量等，与正交实验结果相比较。

2.7 马钱子微囊溶出度的测定 以蒸馏水1 000 mL为溶出介质，转速 100 r/min，温度为(37±0.5)℃［11］。分别将适量微囊 M(g)、适量马钱子粉放入溶出杯中，定时取样5mL，用微孔滤膜过滤，并补入等量同质同温介质，取滤液用高效液相色谱测定峰面积，累积溶出百分率=(C×1 000)/(M×载药量)×100%，以马钱子碱为指标。

3 结果

所制备的微囊，其外观形态圆整、均匀，粒径1.0 mm左右，干燥后的粒径为0.3～0.4 mm。在显微镜下观察微囊形态，见图2。

图2 微囊图片(×100)

按正交设计表L9(34)进行实验，测定各优化指标，计算评估指数Y，结果见表2，方差分析结果见表3。

从表2评估指数的结果可以看出，第8号实验即A3B2C1D3较好。从极差R以及方差分析的结果可以看出，在本实验中，4个因素的影响大小依次为C＞D＞A＞B。然而，油/水比例(C)因素为显著性影响因素，制备时必须选择此因素最佳工艺条件;Span－80用量(B)、囊心/囊材(A)和反应温度(D)均对实验没有显著性影响，在制备时，可根据节省时间、节省原料等原则将其水平进行适量调整。由此，确定最佳工艺条件为囊心/囊材(A)3、Span－80用量(B)2、油/水比例(C)1、反应温度(℃)(D)1，即A3B2C1D1为最终的优化实验方案，与综合评分的结果接近。结果如下:将马钱子细粉加入到EC的丙酮溶液中(1.5∶1 m/m)，在冰水中搅拌30 min，所得混悬液加入到含有表面活性剂司盘－80为3%的液体石蜡中(1∶7 v/v)，将体系温度逐渐升至25℃，保温搅拌一定时间，1 h后过滤，所得固体物用石油醚洗涤3次，室温干燥，得粉末状微囊。

表2 正交实验结果

表3 F检查结果

按照上述实验优化的处方，制备3份微囊，进行正交实验复核实验。包封率和载药量等的测定结果见表4。结果较正交实验8的结果略优。

表4 正交实验复核实验结果

以马钱子碱为指标，测定马钱子粉和马钱子微囊中马钱子碱的累计释放率见图3、4。

图3 马钱子粉中马钱子碱累积释放曲线

由图4和图3对比可知，在0～1 h，微囊中溶出的马钱子碱浓度剧烈增加，马钱子微囊出现暴释现象，在随后的24 h内浓度随着时间的变化稳定均匀增加，相对于马钱子粉表现出缓释性能。因时间问题，对于马钱子微囊出现的暴释问题未能解决。这种现象暗示以乙基纤维素为囊材制作的微囊的溶出可能存在微孔结构之外的更为复杂的机理，有待以后解决。

图4 马钱子微囊中马钱子碱累积释放曲线

4 讨论

本实验选取EC与药物的比例、油/水相比例、表面活性剂的用量、反应温度4个因素，每个因素选取3个水平，选用L9(34)表进行正交实验，以包封率、载药量和微囊粒径为指标综合评估实验结果以优化处方。结果表明，油/水比例(C)因素为显著性影响因素，制备时必须选择此因素最佳工艺条件;Span－80用量(B)、囊心/囊材(A)和反应温度(D)均对实验没有显著性影响，在制备时，可根据节省时间、节省原料等原则将其水平进行适量调整。正交复核实验结果表明，该制备工艺重现性较好，所得微囊颗粒圆整，粒径分布均匀，包封率较高。

在制备过程中，乙基纤维素必须完全溶解于丙酮中，否则影响微囊的形成，但溶解过程缓慢，需在搅拌下放置3～4 d;马钱子微粉应有较小的粒度(粒径应小于120 μm)，否则不易形成微囊;温度由冰水升至25℃的过程应缓慢进行，否则由于丙酮挥发过快，影响微囊的形态和粒度分布;搅拌速度对微囊的粒径有一定的影响，搅拌速度增加，微囊粒径变小，且搅拌速度不易太快，否则影响微囊成型;微囊中药物含量测定时，微囊破碎的程度会影响药物的溶出，故应用力研磨使微囊充分破碎。

临床上使用马钱子治疗各种疾病，特别是疑难杂症，取得了确切的疗效，体现出马钱子具有较高的临床应用价值。但是，其毒性大、治疗窗窄，因而应用受到了限制。乙基纤维素为水不溶性载体材料，吸水后溶胀，适用于作为马钱子微囊囊材。马钱子－乙基纤维素微囊，是否能更好的控制马钱子中生物碱的释放，使马钱子既能很好地发挥治疗作用，又能严格控制其毒副反应对人体的危害，还有待于进一步研究。

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［9］龚 平，吴锦霞，谭天伟.免疫球蛋白缓释微囊的制备、结构表征与性能研究［J］.中国生物工程杂志，2005，25(12):15－19.

［10］中国药典［S］.一部.2005:34.

［11］龚 平，吴锦霞，谭天伟.免疫球蛋白缓释微囊的制备、结构表征与性能研究［J］.中国生物工程杂志，2005，25(12):15－19.