醋柳黄酮在Krebs-Ringer试液中的稳定性研究

谢 燕， 周丽峰， 曾晓丽， 李国文*

(1.上海中医药大学，上海201203;2.上海中医药大学源创科技有限公司，上海201203)

醋柳黄酮(flavonippophae)是从胡颓子科酸刺属植物沙棘(醋柳，Hippophae Rhamnoides L.)中提取获得的黄色或棕黄色粉末。其主要有效成分为黄酮类化合物，主要含槲皮素和异鼠李素及其苷［1］，系难溶性物质，在甲醇、乙醇、乙酸乙酯及碱性水溶液中微溶，在水中极微溶解，这严重影响醋柳黄酮制剂的生物利用度，从而不能充分发挥疗效。本实验在解决醋柳黄酮在肠营养液中溶解性问题的基础上，对醋柳黄酮在Krebs-Ringer试液中的稳定性进行考察，以期为醋柳黄酮肠吸收机理的研究奠定基础。

1 仪器与试药

Sartorius CP225D型电子天平(Made by Sartorius);FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);PHS-3B微机型酸度计(上海理达仪器厂);SK7200LH型超声仪(上海科导超声仪器有限公司);RH-KT/C型加热磁力搅拌器(IKA公司);Agilent Technologies 1200 Series HPLC(美国Agilent公司)。

醋柳黄酮(四川川大华西药业股份有限公司，含量:13.69%，批号:070301);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100081-200406);异鼠李素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110860-200407);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司批号:20080114);Cremophor ELP(巴斯夫公司赠送);磷酸 AR(国药集团化学试剂有限公司 批号:T20061204);无水氯化钙、氯化钠、氯化钾、六水合氯化镁、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、葡萄糖、盐酸及氢氧化钠均为AR(国药集团化学试剂有限公司);甲醇为色谱纯;水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 醋柳黄酮含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备

取槲皮素对照品2 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得槲皮素贮备液;取异鼠李素对照品2.5 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得异鼠李素贮备液。分别精密移取槲皮素贮备液、异鼠李素贮备液1.5 mL至10 mL量瓶用流动相定容，摇匀，即得对照品溶液。每1 mL 中含槲皮素 3 μg、异鼠李素 7.5 μg。见图 1。

图1 醋柳黄酮的HPLC图

2.1.2 色谱条件

Agilent 1200高效液相色谱仪;Kromasil 100-5C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.2%磷酸溶液(50∶50);检测波长:371 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:20 μL。

2.1.3 Krebs-Ringer试液的配制［2］

分别称取无水氯化钙(CaCl2)0.37 g;氯化钠(NaCl)7.8 g;氯化钾(KCl)0.35 g;六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)0.47 g;磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.256 g;碳酸氢钠(NaHCO3)1.37 g;葡萄糖(D-glc·H2O)1.54 g;依次加入至1 000 mL蒸馏水中，搅匀即得。

2.1.4 表面活性剂与乙醇含量对醋柳黄酮溶解度的影响

取适量空白K-R试液，以不同含量的无水乙醇(1%、2%、3%)及表面活性剂 Cremophor ELP(0.5%、1%、2%)组合，配制醋柳黄酮K-R试液，使其中醋柳黄酮原料的含量为100 μg/mL，按前述方法测定醋柳黄酮(以槲皮素和异鼠李素的总和计)的含量。结果如表1。

表1 乙醇含量及表面活性剂含量对醋柳黄酮含量影响的考察/%

由表1的结果可知，在Krebs-Ringer试液中含乙醇量为2%，Cremophor ELP 0.5%时醋柳黄酮溶解度最大，因此，在该基础上进行稳定性考察。

2.1.5 标准曲线

取适量空白K-R试液，其中含乙醇2%、Cremophor ELP 0.5%，调节pH值至6.8。分别取槲皮素、异鼠李素贮备液 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 于10 mL量瓶中，以K-R试液(含2%无水乙醇、0.5%Cremophor ELP，pH6.8)定容至刻度。分别进样，以峰面积对槲皮素和异鼠李素的浓度分别进行线性回归，得槲皮素:C=0.011 6A+0.448 5(r=0.999 0)，异鼠李素:C=0.010 7A+0.122 7(r=0.999 5)，表明槲皮素和异鼠李素分别在0.512 5～8.2 μg/mL和1.225～19.6 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2 醋柳黄酮在K-R试液中的稳定性

2.2.1 醋柳黄酮乙醇浓配液的配制

取醋柳黄酮粉末0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加少量无水乙醇超声20 min使醋柳黄酮溶解，放冷后加无水乙醇定容。每1 mL含醋柳黄酮5 000 μg。

2.2.2 空白K-R试液pH对醋柳黄酮稳定性的影响

分别取适量空白K-R试液，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl调节 pH 值至 5.4、6.8、7.4、7.8、7.9，加入醋柳黄酮乙醇浓配液以及Cremophor ELP，配制醋柳黄酮K-R试液，使其中醋柳黄酮原料的含量为 100 μg/mL，乙醇含量为 2%，Cremophor ELP含量为0.5%，于37℃恒温电热水浴锅中放置5 h，分别于0、1、2、3、4、5 h 时取样测定醋柳黄酮的含量(以槲皮素和异鼠李素的总和计)。

分别计算不同pH的空白K-R试液所配制的醋柳黄酮溶液的降解速率常数Ka(见表2)，以降解速率常数的对数(表示为LnKa)对pH作图，绘制pH-降解速率曲线，考察pH对醋柳黄酮溶液稳定性的影响，结果如图2所示。

图2 不同pH值空白K-R试液中醋柳黄酮的pH-降解速率曲线

表2 空白K-R试液pH对稳定性的影响

由图2可见，醋柳黄酮溶液的降解反应速率受空白K-R试液pH值的影响较大，属于酸碱催化反应。结合表2，可知醋柳黄酮在碱性条件下稳定性较差，而在酸性条件下稳定性较好。

2.2.3 调节醋柳黄酮K-R试液pH后的稳定性

分别取适量空白K-R试液，加入醋柳黄酮乙醇浓配液以及Cremophor ELP，配制醋柳黄酮K-R试液，使其中的醋柳黄酮原料的含量为100 μg/mL，乙醇含量为2%，Cremophor ELP含量为0.5%，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl调节溶液pH值至5.4、6.8、7.4、7.8、7.9，于 37 ℃恒温电热水浴锅中放置5 h，分别于 0、1、2、3、4、5 h 时取样测定醋柳黄酮的含量(以槲皮素和异鼠李素的总和计)。

分别计算醋柳黄酮K-R试液在不同pH值下的降解速率常数Ka(见表3)，以LnKa对pH作图，绘制pH-降解速率曲线，考察pH对醋柳黄酮K-R试液稳定性的影响，结果如图3所示。

图3 醋柳黄酮K-R试液在不同pH值的pH-降解速率曲线

表3 醋柳黄酮K-R试液pH对其稳定性的影响

结合图2、图3及表2，表3可知，直接调节醋柳黄酮K-R试液的pH对其稳定性的影响明显好于调节空白K-R试液的pH值，因此选择直接调节醋柳黄酮K-R试液的pH值来进行相关实验。由于小肠pH在6～7之间，pH5.4偏酸，因此不予考虑。而在pH7.8及7.9下醋柳黄酮K-R试液不稳定，也不予考虑。综合以上结果，选择调节醋柳黄酮K-R试液pH值至6.8及7.4进行深入考察。

2.2.4 时间对醋柳黄酮稳定性的影响

分别取适量空白K-R试液，加入醋柳黄酮乙醇浓配液以及Cremophor ELP，配制醋柳黄酮K-R试液，使其中醋柳黄酮原料的含量为100 μg/mL，乙醇含量为2%，Cremophor ELP含量为0.5%，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl调 pH 值至6.8、7.4，于37℃恒温电热水浴锅中放置 5 h，分别于 0、1、2、3、4、5 h时取样测定醋柳黄酮的含量(以槲皮素和异鼠李素的总和计)。

分别计算醋柳黄酮K-R试液在pH值6.8及7.4下的不同时刻剩余浓度百分比(C不同时刻/C0h×100%，见表4)，以剩余浓度百分比(%)对时间(h)作图(见图4)，并计算RSD值，考察其稳定性。

根据，醋柳黄酮K-R试液在pH6.8和pH7.4下剩余浓度百分比可知，将醋柳黄酮K-R试液pH值调节至6.8时，37℃水浴放置5 h，醋柳黄酮K-R试液仍然稳定，而将醋柳黄酮K-R试液pH值调节至7.4时，37℃水浴放置2 h稳定，5 h则逐渐降解，稳定性较差。

表4 pH值为6.8及7.4时醋柳黄酮K-R试液的稳定性(n=3)

图4 醋柳黄酮K-R试液(pH6.8和7.4)的稳定性

综上所述，可以将醋柳黄酮K-R试液的pH值调至6.8进行实验。

3 讨论

3.1 预试验中发现，醋柳黄酮在肠营养液(K-R试液)中不稳定，而这种不稳定性可能与溶液的pH有关，因此本文系统地研究pH对醋柳黄酮稳定性的影响，以确保醋柳黄酮肠吸收试验的顺利进行。

3.2 由于小肠的pH通常为6～7，一般考察药物在体肠吸收时选择肠循环液 pH6.8、7.4、5.4、7.8、7.9［3-5］，首先调节空白K-R试液的pH值并配制醋柳黄酮K-R试液，发现经过37℃水浴5 h后前后浓度变化较大，若改为直接调节醋柳黄酮K-R试液的pH值，醋柳黄酮的稳定性有明显好转，可能是由于醋柳黄酮中有效成分本身显弱酸性，加入之后会使K-R试液的pH发生改变，因此选择直接调节醋柳黄酮K-R试液的pH值。

3.3 有文献报道［6］醋柳黄酮在pH值较高条件下长时间放置其结构可发生不可逆的变化，从而影响其稳定性，本试验结果也得到相同的结论:醋柳黄酮在碱性溶液中稳定性较差，而在酸性溶液中稳定性较好。此外根据小肠的pH值选择直接调节醋柳黄酮K-R试液的pH值至6.8及7.4，考察其稳定性，由结果可知调节醋柳黄酮K-R试液的pH值至6.8时溶液稳定，而调节醋柳黄酮K-R试液的pH值至7.4时溶液稳定性较差。综上可知，需调节醋柳黄酮K-R试液的pH值至6.8，可确保醋柳黄酮在体肠循环试验的顺利进行。

［1］吴素林.反相HPLC法同时测定沙棘果肉异鼠李素、槲皮素及沙棘总黄酮的含量［J］.沙 棘，1998，11(4):31.

［2］刘太明，蒋学华，张梅娟，等.黄芩苷和黄芩素的大鼠在体肠吸收特性［J］.中国药学杂志，2006，12(41):1784-1787.

［3］宋洪涛，郭 涛，张跃新，等.阿魏酸在大鼠体内肠吸收动力学的研究［J］.中草药，2005，36(10):1516-1517.

［4］李 岩，郭 涛，颜 鸣.泛昔洛韦大鼠在体肠吸收动力学研究［J］.解放军药学学报，2006，22(5):333-335.

［5］游本刚，杨明世，范玉玲，等.尼群地平大鼠在体肠吸收动力学研究［J］. 中国药学杂志，2004，39(3):214-216.

［6］金邻豫，凌春生，王 玮，等.醋柳黄酮在碱性条件下的稳定性研究［J］.河南大学学报(医学版)，2008，27(4):29-31.