槲寄生药材的高效液相指纹图谱研究

于 淼， 徐海燕， 李 飞， 于治国， 赵云丽*

（1.沈阳药科大学高职学院，辽宁沈阳 110026;2.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016）

本实验为当归寄生注射液指纹图谱［1］的研究工作的一部分。当归寄生注射液，由当归和槲寄生两味药材组成，具有舒筋活络、祛风湿、镇痛之功效，用于风湿性关节炎、肥大性脊椎炎、腰膝劳损、腰腿痛、痛经、坐骨神经痛、神经性头痛等证的治疗。方中当归为血中圣药，具有补血活血、化瘀止痛、生肌健骨之功效，槲寄生具有益肝肾、强筋骨、祛风湿、通经络益血之功效［2］。作者曾建立当归药材的高效液相色谱指纹图谱，为当归寄生注射液质量控制提供依据［3］。近代化学成分和药理研究表明，槲寄生主要化学成分有黄酮类、三萜类、苷类、甾醇类等多种化学成分，具有扩张血管、镇静中枢等作用，同时有减少关节积液、改善关节骨端变性及骨质疏松状态、增宽狭窄的关节间隙等作用［4-5］。文献报道，槲寄生药材及其制剂的质量控制方法主要是紫丁香苷和齐墩果酸的含量测定［6-7］。为全面地控制药材质量，本实验对10个产地的槲寄生药材进行了指纹图谱研究及聚类分析。

1 仪器与试药

LC-10ATvp输液泵、SPD-10Avp紫外检测器（日本岛津公司），ANASTA色谱工作站（美国 Suntek Science公司），PHS-2TC精密数显酸度计（上海之信仪器有限公司），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号:0773-9910），乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），冰醋酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂开发中心）。

槲寄生药材（1-山东- 1;2-河北;3-山东-2;4-吉林;5-山东-3;6-山东泰安;7-辽宁鞍山;8-辽宁沈阳;9-山东五莲县;10-山西），由沈阳药科大学孙启时教授鉴定，粉碎过0.45 mm筛，置于干燥阴凉处备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱:Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相:以0.5%冰醋酸溶液（A）和甲醇-四氢呋喃（90∶10，v/v）（B）进行梯度洗脱，程序为0～3 min，0%B;3 ～60 min，0%B ～40%B;检测波长270 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:40℃;进样量:20 μL。理论塔板数以阿魏酸（20号峰）计不低于20 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取阿魏酸对照品约5.0 mg，加水制成每1 mL含50 μg阿魏酸的溶液。

2.2.2 供试品溶液 取槲寄生药材5 g，加水75 mL煎煮2 h，滤过，滤渣加水50 mL煎煮2 h，合并滤液，减压蒸馏至20 mL，加乙醇80 mL，静置48 h，滤过，减压蒸馏至15 mL，并定量稀释至50 mL。将上述溶液与对照品溶液1∶1（v/v）混合后，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 仪器精密度试验 取1号药材粉末，按2.2项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样5次，结果，各色谱峰相对保留时间RSD值为1.1% ～1.5%，相对峰面积RSD值为1.5%～2.9%。

2.4 方法重复性试验 取1号药材粉末，按2.2项下方法平行制备5份供试品溶液，分别测定，各色谱峰相对保留时间RSD值为1.3%～1.9%，相对峰面积RSD值为1.7%～3.0%。

2.5 稳定性试验 取1号药材粉末，按2.2项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于 0、2、4、8、10、24 h 进样分析，各色谱峰相对峰面积RSD值均为1.6% ～2.9%，表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.6 槲寄生指纹图谱的绘制及共有峰的确定 取不同产地槲寄生药材10批，每批1份，按2.2项下方法分别制成供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定、记录色谱图。通过对比上述10个不同批次和产地的槲寄生药材指纹图谱，确定22个共有峰，其中20号峰为阿魏酸，将其作为参比峰。根据各色谱峰对参比峰的相对保留时间定性，各色谱峰相对参比峰的峰面积比值（X）定量。色谱图见图1（为5号样品的色谱图），相对峰面积结果见表1;各样品出峰总数及其共有峰所占比例见表2。

表1 槲寄生药材指纹图谱共有峰相对峰面积

图1 槲寄生高效液相指纹图谱

表2 各样品出峰总数及其共有峰所占比例

2.7 槲寄生药材质量评价方法的确立

2.7.1 系统聚类分析 本研究以经形态学鉴定的10个不同产地和批次的槲寄生样品为研究对象，进行指纹图谱研究，获得包括阿魏酸（20号峰）在内的22个色谱峰。将各色谱峰相对于参比峰的峰面积量化，得到10×22阶原始数据矩阵，运用SPSS软件对其进行系统聚类分析，采用离差平方和法，利用欧氏距离作为样品的测度。聚类分析将10个槲寄生样品分为 2 类，其中 1、2、3、4、5、6、7、8、10 号样品，列为

Ⅰ类，9号样品列为Ⅱ类。聚类谱系图见图2。

图2 槲寄生聚类谱系图

2.7.2 相似度计算 结合聚类分析结果，从10个槲寄生药材中，选取9号之外的其余9批药材的指纹图谱建立共有模式，采用夹角余弦、相关系数计算各样品与共有模式之间的相似度。若样品与共有模式间的夹角余弦和相关系数在0.80以上，则列为Ⅰ类;若低于0.80，则列为Ⅱ类。实验结果表明，相似度分析结果与系统聚类结果一致，两种方法得到了相互验证。待测样品获取指纹图谱数据后，计算其相似度即可评价其质量。结果见表3。

表3 相似度检验结果

3 讨论

当归寄生注射液高效液相色谱指纹图谱研究已对供试品溶液制备方法及色谱系统进行考察，因需进行当归寄生注射液及组方药味的相关性研究，本文采用相同的制备方法及色谱条件。

对比10批槲寄生药材图谱，山东五莲县槲寄生样品的图谱明显不同，相似度明显低于其它批。此外，山东五莲县槲寄生外观不同于其他样品，呈扁枝状金黄色，而其它的槲寄生药材呈圆枝状棕黄色。根据扁枝槲寄生的外观性状的鉴别条件为茎基部圆柱形，具二棱，小枝扁平，绿色，每一节间呈矩圆状倒披针形或近条形，上宽下狭，脉两面具多条，叶退化成鳞片状这些特点后经孙启时教授验证其为扁枝槲寄生。

除9号样品外，10号样品的相似度也明显低于其他几批样品，如果将相似度控制在0.90，那么10号样品也会被单独列为一类，所以在使用类似这样的样品时应慎重考虑。

［1］于 淼，于治国，赵云丽，等.当归寄生注射液指纹图谱研究［J］.中成药，2004，26（8）:607-609.

［2］李正华，詹 奇，粱 笃.补骨方治疗膝骨性关节炎的疗效观察［J］.现代医院，2004，14（4）:12.

［3］于 淼，李 飞，于治国，等.当归药材中水溶性成分指纹图谱的分析［J］.中国冶金工业医学杂志，2008，25（1）:20-22.

［4］赵 晶，贺江萍.槲寄生的化学成分及药理作用研究［J］.天津中医学院学报，2005，24（3）:185-186.

［5］王 俊，王国基，颜 辉，等.槲寄生的化学成分及药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2005，16（4）:300-303.

［6］徐建富，杜秀宝，孔景临，等.RP-HPLC测定槲寄生中紫丁香苷的含量［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（2）:49-50.

［7］刘顺航，王俊全，刘 岩，等.高效液相色谱法测定槲寄生中齐墩果酸的含量［J］.中成药，2008，30（6）:926-928.